АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ И ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРОКСИДАЦИИ У ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ БАЛЬНЕОТЕРАПИИ
Бадмаева Саглар Евгеньевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры общей биологии и физиологии, ФГБОУ ВО «Калмыцкий государственный университет им. Б.Б. Городовикова», Россия, Республика Калмыкия
Теплый Давид Львович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой физиологии, морфологии, генетики и биомедицины, ФГБОУ ВО «Астраханский государственный университет», Россия
Изучено влияние минеральной воды месторождения «Комсомольское» на показатели свободно радикального гомеостаза в условиях эксперимента на животных. Показано, что исследуемая минеральная вода активировала определенные звенья антиоксидантной цепи, повышая активность эритроцитарной каталазы на 65 %, и способствовала ослаблению интенсивности аскорбатзависимого перекисного окисления липидов, что выражалось в значимом снижении концентрации малонового диальдегида в крови опытных животных. Возможно, способность снижать интенсивность окислительных процессов и одновременно с этим активировать системы антиоксидантной защиты может лежать в основе протекторного противоязвенного действия данной минеральной воды.
Ключевые слова:бальнеологические факторы, свободно-радикальный гомеостаз, малоновый диальдегид, антиоксидантные ферменты.
ACTIVITY OF ANTIOXIDANT SYSTEMS AND INTENSITY OF PEROXIDATION PROCESSES IN ANIMALS UNDER THE INFLUENCE OF BALNEOTHERAPY
Badmaeva Saglar E., Cand. Sci. (Biol.), Associate Professor of Department, Kalmyk State University named after B.B. Gorodovikov
Teply David L., Dr. Sci (Bio.), Professor, Head of Department, Astrakhan State University
The influence of the mineral water of the Komsomolskoye deposit on the indicators of free-radical homeostasis was studied in an animal experiment. It has been shown that this mineral water activated certain links of the antioxidant chain (increasing the activity of erythrocyte catalase by 65 %) and helped to reduce the intensity of ascorbate-dependent lipid peroxidation, which resulted in a significant decrease in the concentration of malondialdehyde in the blood of experimental animals. Perhaps the ability to reduce the intensity of oxidative processes and at the same time activate antioxidant protection systems may underlie the protective anti-ulcer action of this mineral water.
Key words: balneological factors, free radical homeostasis, malondialdehyde, antioxidant enzymes.
Введение
Роль окислительного стресса постулирована для многих патологических состояний, его участие доказано при развитии различных заболеваний сердечно-сосудистой, нервной и иммунной систем. В настоящее время принято считать, что окислительный стресс вносит значительный вклад в развитие всех воспалительных заболеваний различного генеза. Известно, что реактивные формы кислорода (РФК) и другие свободные радикалы генерируются как побочные продукты нормальной клеточной метаболической активности [19, 21, 22]. Супероксиддисмутаза (СОД), церулоплазмин, каталаза и глутатион являются ферментами, участвующими в защите клеток от их повреждающего действия. РФК вырабатываются и в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), но их роль в патофизиологии и патогенезе заболеваний органов ЖКТ недостаточно изучена. Несмотря на защитный барьер, создаваемый слизистой оболочкой, стрессогенные факторы различной природы могут вызывать окислительное повреждение и воспалительные реакции ЖКТ с участием эпителия и клеток иммунной системы. Это связано с нарушением свободно-радикального гомеостаза и его сдвигом как в сторону избыточного образования в клетке радикалов и перекисей, так и в сторону снижения адекватного уровня антиоксидантной защиты [4]. Поэтому все чаще патогенез различных заболеваний со стороны слизистой органов ЖКТ, включая язвенную болезнь желудка, рак ЖКТ и воспалительные заболевания кишечника, частично или полностью связывают с окислительным стрессом. Раскрытие сигнальных событий, инициируемых окислительными свободными радикалами, а также физиологических реакций на такой стресс важно для лучшего понимания патогенеза заболевания и разработки новых методов лечения состояний, для которых современные методы лечения не всегда достаточны [5, 23, 24].
Бальнеологические факторы - минеральные воды - уже давно и с успехом применяются для лечения болезней различного профиля, в том числе воспалительной патологии органов ЖКТ. Обладая высокой терапевтической активностью и при этом минимальным набором побочных эффектов, они всегда включаются в комплекс лечения этих заболеваний. Территория Республики Калмыкия располагает значительным запасом лечебных бальнеологических объектов, которые по-прежнему остаются малоизученными. Внимание данного исследования было сосредоточено на минеральных водах месторождения «Комсомольское», так как они активно используются местным населением для лечения заболеваний различных органов и систем, в том числе язвенной патологии желудка. Однако комплексного научного исследования лечебных эффектов минеральных вод этого месторождения, а также механизмов, ответственных за их реализацию, не проводилось [1, 2].
В связи с этим целью данной работы стало изучение в условиях эксперимента показателей активности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и элементов антиоксидантной защиты у животных на фоне воздействия минеральной воды месторождения «Комсомольское».
Материалы и методы исследования
Все эксперименты были выполнены на белых беспородных крысах-самцах весом 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, в пластиковых клетках по 7 животных в каждой, крысы имели свободный доступ к пище и воде. Эксперименты выполняли в соответствии с этическими принципами гуманизации экспериментов на животных, сформулированными Европейским научным фондом (2000 г.).
Предварительно крысы были разделены на 2 группы: контрольную и опытную. Опытная группа в течение 7 дней в качестве питья получала минеральную воду месторождения «Комсомольское» (Республика Калмыкия) общей минерализацией 0,9 г/л (столовое разведение), контрольная группа - обычную водопроводную воду. Количество животных в каждой группе составило 10 особей.
О скорости спонтанного ПОЛ судили по количеству (нмоль/л) образующегося малонового диальдегида (МДА) в крови и гомогенатах печени и желудка, определяемого по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили в случае исходного, спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ (1977) [14]. МДА образует с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) окрашенный в розовый цвет триметиновый комплекс, при этом интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации ТБК-продуктов. Измерение экстинкции всех проб производили на спектрофотометре «Beckman Coulter DU-800» («Beckman Coulter, Inc.», США) при 532 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Активность каталазы в крови (сыворотке и эритроцитарной массе) определяли по методу М.А. Королюка (1988) [9]. Реакция запускается добавлением 0,1 мл плазмы крови или гомогената ткани (100 мг ткани на 1 мл трис-НС1-буфера, 0,05 М, рН 7,8) к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре «Beckman Coulter DU-800» при длине волны 410 нм. Каталазную активность рассчитывали по формуле:
Е = (Ах - Ао)х V X t X K,
где Е - активность каталазы (в нкат/л);
Ах и Ао - экстинкция холостой и опытной проб;
V - объем вносимой пробы (0,1 мл);
t - время инкубации (600 с);
К - коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода (22,2х 103 ммоль"1хсм"1).
Активность СОД в сыворотке крови определяли по методу С. Чевари и соавторов (1985) [16], который основан на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксидные анионы. Измерения оптической плотности производили на спектрофотометре «Beckman Coulter DU- 800» при длине волны 540 нм. Расчет активности СОД (в процентах блокирования) производили по формуле:
где Ео - экстинкция реакционной смеси в отсутствии СОД (нулевой пробы);
Епр - экстинкция исследуемой пробы в состоянии равновесия.
Уровень церулоплазмина - основного медь-протеида крови - определяли по ускоренной методике Э.В. Тен (1981) [15]. Метод основан на реакции окисления парафенилендиамина. Экстинкцию раствора измеряли на спектрофотометре «Beckman Coulter DU-800» при длине волны 440 нм. Активность церулоплазмина определяли в единицах оптической плотности.
Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью LSD-теста пакета прикладных программ Statistica 13.0 (модифицированный t-критерий Стьюдента) (StatSoft, Россия) для нормально распределенных данных. Данные по каждому показателю представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Различия считали значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Минеральная вода месторождения «Комсомольское», сбор которой производили 10 сентября 2018 г., по химическому составу характеризуется как вода хлоридно-натриево-кальциевая, слабокислой реакции (рН = 6,19). По температурной категории относится к холодным водам. По органолептическим характеристикам исследуемая вода прозрачная, представляет собой бесцветную жидкость без запаха, солоноватую на вкус. Наличие токсических веществ: группы азота (нитраты - нитриты - ионы аммония) не превышает норм, указанных в ГОСТ Р 54316-2011 «Воды минеральные природные питьевые». Жесткость воды составила 52,55 ммоль/л.
При изучении показателей свободно-радикального гомеостаза были получены следующие результаты.
Печень. Наиболее значимые изменения МДА обнаруживались в печени, что связано с широким набором ферментных систем в гепатоцитах (до 90 % всех лизосомальных ферментных систем). Так, в случае исходного, спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ его концентрация в гомогенате печени у животных контрольной группы в среднем составила 1,26 ± 0,27; 9,6 ± 1,2 и 107,6 ± 10,4 нмоль/л, соответственно. После 7-дневного поения животных опытной группы минеральной водой содержание МДА в печени незначительно (не установлено достоверных отличий по сравнению с контролем) изменилось по сравнению с соответствующими показателями у крыс контрольной группы и составило 1,5 ± 0,08, 7,9 ± 0,2 и 123,7 ± 2,1 нмоль/л, соответственно (рис. 1).
Рис. 1. Сравнение показателей МДА у животных контрольной и опытной групп в случае исходного, спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ в гомогенатах печени
Кровь. По сравнению с контрольными животными у крыс, получавших в качестве питья воду месторождения «Комсомольское», наблюдались значительно более низкие показатели ПОЛ: на 34 % снизился уровень МДА в случае спонтанного ПОЛ (20,6 ± 3,9 нмоль/л в контроле и 13,6 ± 2,3 нмоль/л в опыте) и на 61 % - при аскорбатзависимом ПОЛ (30,5 ± 2,9 нмоль/л в контроле и 11,9 ± 1,3 в опыте, р = 0,0046) (рис. 2).
Рис. 2. Сравнение показателей МДА в крови у животных контрольной и опытной групп в случае исходного, спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ (* - р < 0,05 к норме)
Таким образом, в отличие от результатов, полученных в отношении динамики МДА в гомогенатах печени контрольных и опытных животных при спонтанном и неферментативном (аскорбатзависимом) ПОЛ, где значения МДА были практически сопоставимы с контрольными или несколько их превышали, в крови наблюдалось значимое уменьшение концентрации ТБК-продуктов у опытных животных под действием минеральных вод, что, возможно, свидетельствует о повышении активности звеньев антиоксидантной цепи в крови.
Желудок. Значения МДА в гомогенатах желудка были значительно ниже по сравнению с печенью, однако имели схожую динамику (рис. 3).
Рис. 3. Сравнение показателей МДА у животных контрольной и опытной групп в случае исходного, спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ в гомогенатах желудка
Так, в желудке контрольных животных уровень МДА в случае спонтанного ПОЛ, вызванного добавлением в образцы дистиллированной воды, составил 13,2 ± 1,9 нмоль/л, при аскорбатзависимом ПОЛ - 8,9 ± 1,7 нмоль/л. Характерной динамики повышения уровня МДА при добавлении аскорбиновой кислоты, наиболее заметной в случае образцов печени и в меньшей степени крови, в отношении тканей желудка обнаружено не было. У опытных животных на фоне потребления минеральной воды месторождения «Комсомольское» наблюдалась тенденция к повышению уровня МДА при неферментативном ПОЛ - уровень МДА в гомогенатах желудка превышал значения контроля на 55 % и составил 14,0 ± 1,3 нмоль/л. Однако достоверной значимости между сравниваемыми результатами обнаружено не было.
Уменьшение продукции ТБК-продуктов (МДА) в крови могло быть вызвано активацией элементов антиоксидантной защиты. В связи с этим в сыворотке крови контрольных и опытных животных была измерена активность таких ферментов антиоксидантной системы, как каталаза, СОД и церулоплазмин. У животных контрольной группы (интактная норма) активность каталазы в крови составила: в сыворотке - 45,85 ± 4,3 нкат/л; в эритроцитарной массе - 11,025 ± 0,9 нкат/л. У животных опытной группы, получавших в качестве питья минеральную воду месторождения «Комсомольское» в столовом разведении, активность сывороточной каталазы по сравнению с контролем практически не изменилась и составила в среднем 45,7 ± 8,6 нкат/л. Значимые изменения (р = 0,021) обнаруживались в отношении эритроцитарной каталазы - ее активность у опытных животных превышала аналогичную в контроле в 4,4 раза и составила 48,5 ± 10,8 нкат/л (рис. 4).
Рис. 4. Сравнение показателей уровня каталазы в крови у животных (сыворотка и эритроцитарная масса) контрольной и опытной групп (* - p < 0,05 к норме)
В отношении активности СОД, измеряемой в процентах блокирования, были получены следующие результаты. В контрольной группе животных она составила 11,6 ± 2,2 %, тогда как в опытной группе - 13,6 ± 2,7 %. Значимых отличий между этими сравниваемыми показателями обнаружено не было (рис. 5).
Рис. 5. Сравнение показателей активности супероксиддисмутазы (в % блокирования) в крови у животных контрольной и опытной групп
Уровень церулоплазмина (в единицах оптической плотности, А) в сыворотке крови контрольных животных составил в среднем 0,47 ± 0,05 А, у животных опытной группы - 0,35 ± 0,08 А (рис. 6). Значимых сдвигов его концентрации на фоне приема минеральных вод также не зафиксировано.
Рис. 6. Сравнение показателей активности церулоплазмина (в единицах абсорбции) в крови у животных контрольной и опытной групп
Заключение
По итогам исследования можно сделать вывод о разнонаправленном действии минеральной воды месторождения «Комсомольское» на различные звенья свободно-радикального гомеостаза в печени, крови и желудке животных. Желудок животных как объект исследования был выбран не случайно, так как изучаемая минеральная вода активно используется местным населением для лечения заболеваний гастроэнтерологического профиля. Для выяснения механизмов, лежащих в основе реализации протекторного эффекта минеральной воды в отношении слизистой оболочки желудка, и было проведено данное исследование.
Известно, что в основе развития любой патологии лежит истощение адаптационного потенциала клетки [13]. Вопросы перехода защитно-приспособительной реакции организма в стадию напряжения и истощения адаптационного потенциала по-прежнему являются одной из важнейших проблем гастроэнтерологии. Для их успешного решения необходимо выяснение клеточных механизмов, которые свидетельствуют о формировании патологической реактивности клетки. Поэтому одним из эффективных способов профилактики воспалительной патологии органов желудочно-кишечного тракта в настоящее время является использование антиоксидантов, так как уже на ранней стадии развития адаптации происходит мобилизация ингибиторов свободно-радикальных процессов в клетке, вследствие чего может возникнуть их дефицит и сдвиг клеточного гомеостаза, приводящего к избыточному накоплению в клетке реактивных продуктов перекисного окисления липидов [6, 7].