При непрерывном культивировании в производстве микробного белка углеводороды растворы солей вводят в ферментер раздельно по индивидуальным линиям, а смешение и эмульгирование нерастворимых в воде n-алканов происходит уже в самом биореакторе.
При периодической ферментации в начале процесса инокулят вносится в уже готовую питательную среду, содержащую все компоненты.
Поэтому источники углерода вводят непосредственно перед засевом или отдельные компоненты среды вводят по мере потребления их культурой.
Получение и подготовка посевного материала
Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства. Сначала чистую культуру размножают в лаборатории, затем в цехе чистых культур и инокуляции, далее направляют на культивирование.
В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов - монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях.
Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - ключевая задача любого биотехнологического производства.
Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. [4]
Стерилизация питательных сред, оборудования и воздуха
Асептика - это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду или на объект посторонних микроорганизмов.
Необходимость обеспечения асептических условий в биотехнологических процессах обусловлена следующими факторами:
- посторонние микроорганизмы-контаминанты потребляют компоненты питательных веществ и при этом выделяют метаболиты, тормозящие рост основной культуры;
- развитие контаминантов неконтролируемо влияет на условия режима роста и раз-вития основной культуры;
- наличие в культуральной жидкости посторонней микрофлоры и продуктов ее жизнедеятельности затрудняет выделение целевого продукта и снижает его качество.
Стерилизация всех компонентов биотехнологического процесса, соприкасающимися с чистыми культурами микроорганизмов - важнейший этап биотехнологического производства.
Методы, применяемые для исключения попадания в культуру посторонней микрофлоры, основаны на задержке или уничтожении микроорганизмов. Добиться требуемой чистоты вещества возможно установкой физической преграды для микроорганизмов (фильтры) или уничтожив их до подачи в стерильный объект.
К способам стерилизации, основанным на уничтожении микроорганизмов, относят термическую, химическую и радиационную стерилизацию, которые применяют для обеззараживания оборудования, коммуникаций, питательных сред и технологических растворов.
В качестве стерилизующего агента при термической стерилизации обычно используют водяной пар, подаваемый под различным давлением и температурой. Так, пустые аппараты и коммуникации чаще всего стерилизуют насыщенным водяным паром; питательные среды и другие жидкости - путем нагревания под давлением, в ряде случаев применяют горячий воздух (сухой жар). Сухой горячий воздух используют для стерилизации материалов и предметов, которые могут быть испорчены при обработке паром (безводные жиры, масла, порошки, предметы, подверженные коррозии, и т.п.).
Химическую стерилизацию применяют для тех элементов оборудования, которые не выдерживают нагревания до 110 - 130 єС (например, датчики, фильтры воздуха и т.п.).[1]
Очистка и стерилизация воздуха
Важным технологическим процессом в биологических производствах является очистка от механических включений и стерилизация воздуха, используемого для вентиляции цехов и боксов, передачи под давлением стерильных культуральных жидкостей и растворов, поддержания избыточного давления в стерильных емкостях. В значительных количествах стерильный воздух используется для аэрации процесса культивирования.
Очистка отработанного воздуха
Отводимый из лабораторных и производственных помещений отработанный воздух также должен подвергаться очистке от присутствующих в нем микроорганизмов и контролироваться на чистоту. Большая запыленность воздуха белковыми и другими и другими продуктами микробного синтеза отмечается на стадиях сушки, упаковки и погрузки в вагоны. биотехнологический микроорганизм ферментация
Значительная запыленность воздуха питательными солями и сырьем (опилки, отруби, мука и др.) имеет место в отделениях и цехах приготовления питательных сред.
Одним из важнейших мероприятий, снижающих выброс микроорганизмов в окружающую среду, является герметизация ферментеров, флотаторов и оборудования узла сепарации.
3.2 Стадия ферментации
Является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, эндо- и экзопродуктов).
Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил стерильности (так называемая незащищенная ферментация); на жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды).
Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом.
При периодическом способе культивирования ферментер заполняется исходной питательной средой и инокулятом микроорганизмов. В течение определенного периода времени в аппарате происходит взаимодействие микроорганизмов и субстрат, сопровождающееся образованием в культуре продукта.
Биохимические превращения в этом аппарате продолжаются от десятков часов до нескольких суток. Регуляция условий внутри ферментера - важнейшая задача периодического культивирования микроорганизмов. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий, изображённых на рисунке 1: лагфазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды.
Рисунок 1. Кривая роста микроорганизмов в ходе периодической ферментации: 1 - лаг-фаза; 2 - фаза экспоненциального роста; 3 - фаза линейного роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза; 6 -фаза отмирания
Процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательные компоненты и инокулят, а из другого с той же скоростью вытекает культуральная жидкость. Данная система проточной ферментации гетерогенна. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются.
Биотехнологическая стадия
Основной стадией является собственно биотехнологическая стадия. На этой стадии с помощью биологического агента (микроорганизмов, изолированных клеток, ферментов или клеточных органелл) сырье преобразуется в тот или иной целевой продукт.
Биотехнологическая стадия включает в себя следующие процессы:
1. Ферментация - процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов.
2. Биотрансформация.
3. Биокатализ - химические превращения вещества, которые протекают с использованием биокатализаторов - ферментов.
4. Биоокисление - потребление загрязняющих веществ с помощью микроорганизмов в аэробных условиях.
5. Метановое брожение - переработка органических отходов с помощью ас-социации метаногенных микроорганизмов в анаэробных условиях.
6. Биокомпостирование - снижение содержания вредных органических веществ микроорганизмами в твердых отходах, которым придана специальная взрыхленная структура для обеспечения доступа воздуха и равномерного увлажнения.
7. Биосорбция - сорбция вредных примесей из газов или жидкостей микроорганизмами, обычно закрепленными на специальных твердых носителях.
8. Бактериальное выщелачивание.
9. Биодеградация - деструкция вредных соединений под воздействием микроорганизмов-биодеструкторов.[2]
Отделение биомассы от культуральной жидкости
Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологических процессах, чрезвычайно широк. По разнообразию и объемам производства на первом месте стоят продукты, получаемые в процессах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Эти продукты подразделяются на три основные группы:
1 группа - биомасса, которая является целевым продуктом (белок одноклеточных) или используется в качестве биологического агента (биометаногенез, бактериальное выщелачивание металлов);
2 группа - первичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения, необходи-мые для роста микроорганизмов в качестве строительных блоков макромолекул, ко-ферментов (аминокислоты, витамины, органические кислоты);
3 группа - вторичные метаболиты (идиолиты) - это соединения, не требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (антибиотики, алкалоиды, гор-моны роста и
Чаще всего целевой продукт находится либо в самой биомассе, либо в жидкости. В обоих случаях необходимо сначала разделить эти две фазы. В зависимости от свойств биомассы и жидкости для этих целей могут быть использованы различные процессы.
Отстаивание - разделение под действием гравитационных сил (обычно при очистке сточных вод).
Фильтрация - пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживаются частицы твердой фазы - биомасса.
Такой способ применяют в производстве антибиотиков, особенно в тех случаях, когда микроорганизм-продуцент имеет мицелиальный характер.
Сепарация, центрифугирование - разделение под действием центробежных сил. Наиболее часто используется для отделения дрожжей или бактерий в производстве кормовой биомассы.
Микрофильтрация, ультрафильтрация - пропускание суспензии через мембраны с весьма малым размером пор, обеспечивающее удержание клеток микроорганизмов на мембране и получение раствора, свободного от взвешенных клеток. Ультрафильтрация задерживает не только клетки, но и крупные молекулы растворенных веществ.
Коагуляция - добавление в суспензию реагентов, пособствующих образованию и осаждению более крупных клеточных агломератов и отделению их от жидкости путем отстаивания.
Флотация - захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции.[7]
3.3 Постферментационная стадия
Обеспечивает получение готовой товарной продукции и также, что не менее важно, обезвреживание отходов и побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру и методы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках.
Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы - биомассы.
Наиболее распространенный для этих целей метод - сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах - сепараторах, которые работают по различным схемам в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости.
Основные проблемы возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц с размером 0,5-1,0 мкм и менее (бактериальные клетки) и необходимостью переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка, ряда аминокислот). Для повышения эффективности процесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры - изменение рН, нагревание, добавление химических агентов.
Для увеличения сроков годности биотехнологических продуктов производят их обезвоживание и стабилизацию.