в [783] область состояла из 134 нуклеотидов, а в [571] применялась область из 228
нуклеотидов. Существенность размеров модифицируемых областей последовательностей объясняется тем, что для области, состоящей из k нуклеотидов,
пространство решений имеет размер 4k. Поэтому при увеличении размеров области экспоненциально возрастает вычислительная нагрузка при подготовительном моделировании для направленной эволюции. Кроме того, чисто технически лабораторное оборудование позволяет использовать от 0.1 до 10 nmol вещества, что соответствует примерно от 421 до 427 последовательностей.
Учитывая имеющиеся ограничения по размеру, действия полным перебором весьма нежелательны. Поэтому большое внимание уделяется не только размерам модифицируемых областей, но и другим существенным деталям и ограничениям:
расположению модифицируемой области в последовательности, отношению количества нуклеотидов разных видов и т.д. Например, в [324] в качестве исходной была взята последовательность
GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAAAGACGGT
GAAACTGAAATCTAATCCGTCTGAACCCTG
GATTTCGACATGAGGCCCGGATCCGGC,
состоящая из 87 нуклеотидов, у которой изменялся участок между 24-м и 63-м
нуклеотидами, при этом заменялось 30% от общего количества нуклеотидов. Степень изменения исходной последовательности может определяться в зависимости от общего количества нуклеотидов (как в только что рассмотренном примере) или в зависимости от количества нуклеотидов, для которых изменения допустимы. Например, в [163]
рассматривались последовательности
CGACGTCGCTCGAATGCTGATAGTAGTTCTCC
TTTAAGGAGTTTGGGTGGTGGGTGGGTGTTAG
56
ATGTTGAGATCGTTAGCATGTTTCGCCGAGCTA
и
CGACGTCGCTCGAATGCCGGGCTCGCGTTGCC
GAGGGGGTGGGTTTGGGTCACCACTGGCGTAG
GAAGCCAAGGGTGTGGTGTGCAGCGCCGAGCTA,
у которых модифицировались нуклеотиды с 18-го по 79-й с вероятностью 12%.
Несколько более простой подход рассмотрен, например, в [963]: исходная последовательность вообще не рассматривалась, а требуемая последовательность строилась в предположении, что начальный отрезок имеет вид
GGGACAGGGCTAGC,
заключительный отрезок имеет вид
GAGGCAAAGCTTCCG,
а по середине расположены 30 случайных нуклеотидов. В [163] применялась направленная эволюция последовательности, у которой начальный отрезок имеет вид
CGACGTCGCTCGAATGC,
заключительный отрезок имеет вид
CGCCGAGCTAGAGGTCCTTC,
57
а по середине расположены 70 нуклеотидов, представляющих собой случайную последовательность с примерно равным количеством вхождений A, G, C и T. В [944]
применялась направленная эволюция последовательности, у которой начальный отрезок имеет вид
GGTTGGCAGCAGAAGATAGCA,
заключительный отрезок имеет вид
GTCGGTCAAGGGAGGGATCCTA,
а по середине расположены 60 нуклеотидов, представляющих собой случайную последовательность с количеством вхождений нуклеотидов A, G, C и T,
распределенным в отношении 25/25/30/20.
Рассматриваются и более тонкие подходы к организации направленной эволюции. Например, можно взять за основу не случайную последовательность, а уже готовое РНК-устройство. После этого запускается процесс малых изменений,
направленный на получение новых полезных свойств с сохранением ранее полученных.
В частности, в работе [430] за основу был взят сенсор АТФ:
AGCCAGCTTAATGAGCAAGGGGGTTGCTGGCACCGAAGTG
CCACAGTTTCTTCCCAACCCGGCGTACATGCAACCACTCC.
Начальный участок последовательности
AGCCAGCTTAATGAGCAAGG
и заключительный участок
GGCGTACATGCAACCACTCC
58
были оставлены без изменений, к заключительному участку была добавлена последовательность
TATAGTGAGTCG TATTACGC,
а средний участок
GGGTTGCTGGCACCGAAGTGCCACAGTTTCTTCCCAACCC
подвергался незначительным модификациям. Другой интересный подход к направленной эволюции предложен в работе [963]. Для сенсора
GGGACAGGGCUAGCAGUAGGAUUGGGUGAGGGGAUGUGCUG,
полученного обычными методами направленной эволюции, структура слабых связей
1 – 40, 2 – 39, 4 – 37, 5 – 36, 6 – 35, 10 – 33, 11 – 32, 13 – 27, 14 – 26
оказалась интересной с функциональной точки зрения, но не устойчивой. Для закрепления структуры слабых связей такого типа была проведена направленная эволюция, критерием которой выступала стабильность слабых связей. Полученная в результате последовательность сенсора имеет вид:
GGGCUAGGGCUAGCAGUAGGAUUGGGUGAGGGGAUAGCC.
При этом в схеме слабых связей пара 1 – 40 была заменена на 3 – 38. Следует отметить,
что идея повторной селекции является достаточно распространенной (см., например,
[153], [196] – [200], [252], [346], [389], [416], [431], [519], [552], [594], [609]). При этом направленная селекция не обязательно преследует своей целью улучшение уже полученной последовательности. Например, в [433] к уже готовому сенсору была
59
добавлена новая случайная область, после чего процесс направленной эволюции был повторен. Повторная селекция может применяться не только к искусственно синтезированным устройствам, но и к последовательностям РНК природного происхождения (см., например, [508], [656]). Кроме того, в отдельных случаях модификация областей РНК осуществлялась не только с использованием обычных нуклеотидов, но и искусственно синтезированных (см., например, [661], [845]). При этом искусственные нуклеотиды применяются не только для повышения разнообразия случайных последовательностей, но и в чисто технических целях. Например, могут применяться нуклеотиды 5-iodouracil для привлечения методов фотохимии к организации лабораторного процесса (см. [356], [449]).
Как правило, механические сенсоры конструируются для обнаружения небольшого фиксированного фрагмента генетической последовательности, который характерен только для последовательностей такого вида и не встречается в других последовательностях. Например, в [112] рассматривается следующий фрагмент,
состоящий всего из девятнадцати нуклеотидов (см. также [732]):
AGCGCGTGATGAACTTCGA.
Такая стратегия наилучшим образом работает для объектов распознавания существенно различающихся между собой. Однако ведутся исследования и в области создания механических сенсоров, позволяющих распознавать и незначительно отличающиеся последовательности. В частности, в [359] предложена конструкция сенсора, разделяющего Human Influenza A virus A/Panama/2007/1999(H3N2) и Human Influenza A virus A/Aichi/2/1968(H3N2). В случае с Human Influenza A virus A/Panama/2007/1999(H3N2) и Human Influenza A virus A/Aichi/2/1968(H3N2) оба вируса являются патогенными. Поэтому, вообще говоря, их разделение представляет интерес преимущественно с точки зрения выбора правильного метода лечения, а обнаружение возможно стандартными медицинскими способами. Несколько иная ситуация с Prion Protein (PrP). Этот белок имеет две формы: PrPC и PrPSc [1008]. Форма PrPC является безвредной, но имеет тенденцию к переходу в форму PrPSc. Форма PrPSc вызывает такие заболевания как Creutzfeldt–Jacob disease и Gerstmann–Straussler–Scheinker syndrome
60