Статья: Генетико-биохимические особенности мутантных линий сои

ГЕНЕТИКО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МУТАНТНЫХ ЛИНИЙ СОИ

соя мутагенез химический

А. А. Топтиков1, к.б.н., доцент,

Д. А. Жарикова1, аспирант

Г. А. Чеботарь1, к.б.н., доцент И. В. Темченко2, ст. научн. сотр.,

А. В. Чеботарь1,3, д.б.н., профессор

Одесский национальный университет имени И. И. Мечникова, кафедра генетики и молекулярной биологии, ул. Дворянская, 2, Одесса, 65082, Украина 2Институт кормов и сельского хозяйства Подолья НААН Украины, проспект Юности, 16, Винница, 21100, Украина

3Селекционно-генетический институт - Национальный центр семеноведения и сортоизучения НААН Украины, Овидиопольськая дор., 3, Одесса, 65036, Украина

С помощью аллозимного анализа проведен сравнительный популяционно-генетический анализ мутантных линий сои, полученных в результате химического мутагенеза сорта Фемида, а также сортов Фемида и Корада. В качестве белковых маркеров использовали энзимы обмена активных форм кислорода: НАДФ^Н-оксидазу, пероксидазу и супероксиддисмутазу. Установлена значительная генетическая гетерогенность исследуемых образцов. Показано, что генетические дистанции между разными группами сои, несмотря на высокий уровень гетерогенности, находятся в рамках внутривидовых границ. Выявлены достоверные корреляционные отношения между некоторыми локусами изозимов и рядом хозяйственно ценных признаков сои, а также геном фотопериодической чувствительности Е7.

Ключевые слова: Glycine max (L.); аллозимы; генетическая структура; генетическая дистанция; корреляция; ген Е7; фотопериодическая чувствительность.

Соя (Glycine max (L.) Merr.) является ценной сельскохозяйственной культурой, благодаря богатому биохимическому составу ее семян и зеленой массы в целом, а также способности растений обогащать почву усвояемым азотом за счет симбиоза с клубеньковыми микроорганизмами. Однако ее распространение в средних и высоких географических широтах ограничивается особенностями биологии этого вида. Соя относится к тепло- и влаголюбивым, чувствительным к фотопериоду короткодневным растениям, требовательным к плодородию почвы с довольно длинным вегетационным периодом в средних географических широтах [15]. В связи с этим, в условиях Украины для стабильного получения урожая этой культуры необходим продуманный подбор сортов сои со свойствами, адекватными конкретному региону выращивания [10].

Одним из свойств, влияющих на продуктивность сои, является начало и продолжительность репродуктивного периода в цикле развития растений [37]. Это определяет важность одного из приоритетных направлений в селекции сои: изучение генетических факторов, ответственных за реакцию растений к продолжительности светового периода [10].

Успешная селекция любой культуры зависит от разнообразия исходного материала. Одним из источников необходимого разнообразия является гибридизация. Однако для сои этот подход крайне трудоемок и дает низкий выход гибридных семян [13]. Дополнительным источником повышения разнообразия селекционного материала сои выступает искусственный мутагенез [4]. В Институте кормов и сельского хозяйства Подолья НААН Украины (1КСГП, г. Винница) путем химического мутагенеза получены мутантные линии сои, различающиеся по морфологическим, физиологическим показателям, а также по чувствительности к фотопериоду.

Ранее мы определяли полиморфизм мутантных форм сои по микросателлитным локусам Satt 100 и Satt 319 [8; 42]. Целью данной работы было изучение генетико-биохимических особенностей линий сои, полученных после обработки семян химическими мутагенами. Для достижения этой цели ставились следующие задачи: 1) определить популяционно-генетические показатели образцов сои; 2) установить генетические дистанции между линиями и родительским материалом; 3) выявить возможные коррелятивные отношения между локусами исследуемых энзимов и другими генетическими системами, а также морфофизиологическими параметрами.

Материалы и методы исследования

Исследовали две мутантные линии сои, полученные на основе сорта Фемида: Фемида М29 (n=9), Фемида М32 (n=12), а также сорта Фемида (n=10) и Корада (n=9).

Гомогенаты получали из недельных этиолированных проростков, выращенных в чашках Петри при температуре +26-27 °С. Для получения экстрактов ткани гомогенизировали в буфере для следующего состава: 0,05 М Трис-HCl (рН 6.8), 0,01 % дитиотреитол, 0,01 % аскорбиновая кислота, 0,01 % натриевая соль ЭДТА, 1 % тритон Х-100, 15 % сахароза. Соотношение ткань: буфер (масса в мг: объем в мкл) составляло 1 : 1. Пробы растирали непосредственно в центрифужных пробирках, 3 раза подвергали замораживанию-оттаиванию, после чего центрифугировали 20 мин при 10000 g при температуре +4 °С. Электрофоретическое разделение белков проводили в системе Дэвиса [21] в 10 % ПААГ в аппарате VE-4M («Хеликон», Россия) в пластинах 130^110^1 мм. Энзимы в гелях детектировали в соответствии с рекомендациями [31]. Пероксидазу (POX, КФ. 1.11.1.7) выявляли с использованием бензидина в качестве субстрата энзима, НАДФ-Н-оксидазу (NPOX, КФ 1.6.2.4) и супероксиддисмутазу (SOD, КФ 1.15.1.1) проявляли по восстановлению красителя нитротетразолиевого синего.

Анализ популяционно-генетических показателей исследуемых групп сои (линия или сорт) проводили согласно общепринятым подходам и формулам [1-3, 16, 22, 30, 32, 35, 39, 40]. Рассчитывали частоту аллелей и их ошибку, эффективное число аллелей п наблюдаемую гетерозиготность по отдельным локусам Н среднюю наблюдаемую гетерозиготность по всем локусам Нат и их стандартную ошибку, ожидаемую гетерозиготность по каждому отдельному локусу Н среднюю ожидаемую гетерозиготность по исследуемым локусам НЕа и ее стандартную ошибку, полокусный и средний дефицит гетерозиготности по всем исследуемым локусам (DH и DHav), их ошибку и достоверность. Соответствие фактических частот генотипов теоретически ожидаемым частотам согласно уравнению Харди-Вайнберга оценивали с помощью критерия %2 при 5 % уровне значимости.

Коэффициент инбридинга для каждой исследуемой группы F рассчитывали через отношение наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности

где Н0 и HE - наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность в отдельной группе.

Количественную оценку степени близкородственного скрещивания осуществляли с помощью коэффициентов инбридинга Райта: FIS (коэффициент инбридинга особи конкретной группы, к которой она относится, показатель дефицита гетерозиготности в отдельной группе или гетерогенность отдельной группы), FIT (коэффициент инбридинга особи относительно всей совокупности групп или гетерогенность в целом всех исследуемых образцов сои) и FST (коэффициент инбридинга исследуемой группы относительно всех исследуемых образцов, показатель дифференциации между исследуемыми группами).

Оценку генного разнообразия проводили также с помощью G^-статистики согласно протоколу [22]. Определяли HT - общее для всех образцов генное разнообразие, HS - внутрисортовое (внутрилинейное) генное разнообразие, DST - межгрупповое разнообразие, GST - межгрупповую дифференциацию, трактуемую как долю генного разнообразия, распределенное между группами.

Степень генетического подобия I и отдаленности D рассчитывали по Нею (анализ по частотам аллелей) и по индексу генетического подобия Джеффриса-Матуситы (анализ по частотам генотипов) (GSI).

Все расчеты популяционно-генетических показателей осуществляли с помощью матриц, созданных в пакете Microsoft Excel.

Уровень связи между разными параметрами растений оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона в программе Microsoft Excel. Для вычисления коэффициентов корреляции качественные показатели (аллели, генотипы) оцифровывали, количественные данные (продолжительность вегетационного периода, высота растения высота формирования нижних бобов) ранжировали, придавая им значения 0, 1 и т.д. в зависимости от количества показателей и рангов.

Результаты исследования и их обсуждение

Электрофоретические спектры исследуемых энзимов - НАДФН-оксидазы (NPOX), пероксидазы (POX) и супероксиддисмутазы (SOD) - показаны на рис. 1. Выбор энзимов обусловлен их ключевой ролью в регуляции содержания и соотношения в клетках активных форм кислорода (АФК). Последние, как известно, выполняют функцию посредников, сигнальных молекул в ответной реакции организмов на разные биотические и абиотические воздействия со стороны окружающей среды, фотопериод в том числе [7; 14; 19; 20; 23-29; 34; 36; 41].

При генетической трактовке электрофоретических спектров НАДФ-Н-оксидазы и пероксидазы исходили из известных данных о мономерной организации этих энзимов [31]. Спектры супероксиддисмутазы также адекватно описывались такой моделью. Всего выявлено семь локусов POX и по шесть локусов NPOX и SOD. Причем в зависимости от генотипа некоторые локусы проявляли себя по-разному. У сорта Фемида и производных от него мутантных линий локус NPOX-1 был мономорфным по изоформе с электрофоретической Rf 0,33 подвижностью.

Однако у некоторых растений сорта Корада не обнаруживалось этой формы энзима, что позволяло трактовать локус NPOX-1 как полиморфный с нуль-аллелем. Подобная ситуация была с локусами POX-1, POX-2, POX-4 и SOD-4 (табл. 1).

Всего из 19 локусов исследуемых энзимов 15 были полиморфными с двумя выявляемыми аллелями. Таким образом, по исследуемым ген-энзимным системам соя характеризовалась значительной полиморфностью (0,79).

Результаты расчета популяционно-генетических показателей исследуемых образцов сои представлены в табл. 2-5.

Как видно из табл. 2, по ряду локусов наблюдались особенности в частоте встречаемости аллелей в исследуемых выборках сои. Сорт Корада отличался от остальных образцов в большей степени. Всего с учетом только полиморфных локусов Корада разнился по частоте встречаемости аллелей от остальных образцов почти по половине локусов: семи из 15 (в табл. 2 помечено полужирным шрифтом).

Мутантные линии по сравнению с родительской формой также имели отличия по частоте встречаемости аллелей: линия М29 - по трем локусам (20 %), М32 - по четырем (27 %).

Из общих закономерностей относительно изменений частоты встречаемости аллелей следует отметить следующее. Наиболее стабильными из полиморфных локусов являлись локусы НАДФ^Н-оксидазы, наибольшим изменениям подвергался аллельный состав локусов пероксидазы и полиморфных локусов

Рис. 1. Электрофореграммы молекулярных форм НАДФ'Н-оксидазы (а), пероксидазы (б) и су- пероксиддисмутазы (в) исследуемых образцов сои: 1-10 - номера треков; 1, 2 - линия Фемида М32, 3, 4 - линия Фемида М29, 5-7 - сорт Корада, 8-10 - сорт Фемида; Я/- относительная электрофоретическая подвижность молекулярных форм энзимов.

Таблица 1

Проявление аллелей в локусах исследуемых энзимов в разных образцах сои

Примечание: Rf -- относительная электрофоретическая подвижность аллозима; +, -- присутствие, отсутствие аллозима в исследуемой группе растений; сочетание «+» и «0-аллель» означает присутствие аллозима у части растений исследуемой группы; сочетание «-» и «0-аллель» означает отсутствие аллозима у всех растений исследуемой группы.

Таблица 2

Встречаемость аллелей в разных группах сои