Статья: Хромохелкозис - необычная форма хромосомной нестабильности и соматического мозаицизма, связанная с болезнями центральной нервной системы у детей

ХРОМОХЕЛКОЗИС - НЕОБЫЧНАЯ ФОРМА ХРОМОСОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ И СОМАТИЧЕСКОГО МОЗАИЦИЗМА, СВЯЗАННАЯ С БОЛЕЗНЯМИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У ДЕТЕЙ

молекулярный кариотипирование аномалия хромосомный

Юров И.Ю.^1,2, Ворсанова С.Г.^1,2, Куринная О.С.^1,2, Зеленова М.А.^1,2, Васин К.С.^1,2, Демидова И.А.^1,2, Харламова А.А.^1,3, Юров Ю.Б.^1,2, Куцев С.И.⁴

¹ Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр психического здоровья», Москва

²Обособленное структурное подразделение «Научно-исследовательский клинический институт педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева» Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова», Москва;

³Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)», Москва;

⁴Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова», Москва

Механизмы образования хромосомных аномалий и нестабильности, приводящих к широкому спектру заболеваний у детей, до конца не изучены. В настоящей работе с помощью молекулярного кариотипирования и оригинального биоинформатического метода у детей с заболеваниями центральной нервной системы (такими как умственная отсталость, аутизм, эпилепсия) и врожденными пороками развития (n=705) были обнаружены регулярные хромосомные перестройки (делеции/дупликации) или вариации числа копий последовательности ДНК (CNV), расположенные совместно с соматическими (мозаичными) хромосомными аномалиями (n=57, 8,1%). Детальный анализ результатов молекулярного кариотипирования и изменений генных сетей, связанных с обнаруженными CNV, позволил предложить механизм образования необычной формы хромосомной нестабильности и мозаицизма, которую мы обозначили как «хромохелкозис» (древнегреч. «хромосомное изъязвление»/«хромосомная язва»). Более того, было показано, что хромосомный дисбаланс может вызывать локальную нестабильность в точках разрыва аномалии, приводя либо к потере части или всей хромосомы (делеции или анеуплоидии), либо к дополнительному удвоению (дупликации) участков, фланкирующих перестройку. Анализ особенностей перестроек хромосомных вариантов в исследованной группе детей дал возможность ассоциировать хромохелкозис с соответствующими клиническими проявлениями заболеваний, а также выдвинуть гипотезу о функции некодирующей классической/альфа-сателлитной ДНК, заключающейся в «защите» участков хромосом рядом с центромерой, нарушение которой приводит к потере хромосомы при дальнейшем делении клетки. На основе современных медико-биологических представлений о хромосомной нестабильности была предложена «цитогеномная теория», объясняющая вклад хромохелкозиса в патогенез болезней мозга, онкологических заболеваний и старения, а также в особенности «поведения» хромосом в онтогенезе. Принимая во внимание возможные ограничения представленной нами теории, мы все же полагаем, что исследования таких форм геномной (хромосомной) нестабильности, как хромохелкозис, необходимы для понимания межклеточной вариабельности и пластичности генома соматических клеток.

Ключевые слова: хромосома, вариации числа копий последовательностей ДНК (CNV), хромосомная нестабильность, соматический мозаицизм, анеуплоидия, центральная нервная система, болезни мозга, цитогеномика.

CHROMOHELKOSIS - A UNUSUAL FORM OF CHROMOSOME INSTABILITY AND SOMATIC MOSAICISM ASSOCIATED WITH CENTRAL NERVOUS SYSTEM DISEASES IN CHILDREN

Iourov I.Y.^1,2, Vorsanova S.G.^1,2, Kurinnaia O.S.^1,2, Zelenova M.A.^1,2, Vasin K.S.^1,2,

Demidova I.A.^1,2, Kharlamova A.A.^1,3, Yurov Y.B.^1,2, Kutsev S.I.⁴

Mental Health Research Center, Moscow

²Veltischev Research and Clinical Institute for Pediatrics of the Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russian Federation, Moscow;

³The Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University), Moscow;

⁴Research Centre for Medical Genetics, Moscow

The formation of chromosome instability and somatic mosaicism mediating a wide spectrum of childhood diseases is poorly understood. Using molecular karyotyping and original bioinformatic method, children (n=705) suffering from central nervous system diseases (intellectual disability, autism, epilepsy) were found to demonstrate colocalized regular chromosomal imbalances or copy number variations (CNV) with mosaic ones (n=57, 8.1%). Analyzing molecular karyotyping results and pathways altered by CNV, we proposed a mechanism for a previously unknown form of chromosomal instability and mosaicism. We designated it as «chromohelkosis» (ancient Greek for chromosome ulceration/chromosome ulcer). Additionally, chromosomal imbalances were shown to produce local instability in the breakpoints, which led to losses of a chromosomal part or whole chromosome (deletion or aneuploidy) as well as to further duplication of the flanking chromosomal loci. Studying peculiarities of the rearrangements and chromosomal variants allowed us to uncover the association between chromohelkosis and clinical manifestations of chromosomal imbalances as well as to propose a hypothesis concerning functional significance of non-coding classical/alpha satellite DNA. The later refers to the protection of centromere, the loss of which results in chromosomal loss during further cell divisions. Taking into account current biomedical knowledge about chromosomal instability, we developed a cytogenomic theory describing specific chromosome behavior in ontogeny, as well as the role of chromohelkosis in pathogenesis of brain diseases, cancers, and aging. Regardless limitations of the theory, we suggest that studying specific forms of chromosomal instability (e.g. chromohelkosis) are required for understanding intercellular variability and plasticity of the somatic cell genome.

Keywords: chromosome, copy number variations (CNV), chromosome instability, somatic mosaicism, aneuploidy, central nervous system, brain diseases, cytogenomics.

Несмотря на то что хромосомная нестабильность и соматический мозаицизм связаны с широким спектром заболеваний, механизмы возникновения данных форм вариабельности генома до настоящего времени остаются загадкой [1, 2]. Тем не менее, в литературе имеются описания катастрофического поведения генома, приводящего к особым видам его нестабильности: хромотрипсис, хромоанасинтез и хромоанагенез [3]. Изучение процессов, лежащих в основе наиболее распространенных типов хромосомной нестабильности и мозаицизма (например, соматической анеуплоидии), показало, что данные формы межклеточной вариабельности генома, вероятно, являются результатом изменений ряда молекулярных/клеточных процессов, связанных с генными и хромосомными мутациями, а также с генетическими взаимодействиями с окружающей средой. В биомедицинском контексте становится необходимой оценка вклада наследственных и спорадических (цито)геномных вариаций на хромосомном и субхромосомном уровнях в формирование геномной нестабильности и соматического мозаицизма с помощью полногеномного анализа и методов, основанных на теории систем (биоинформатики или биологии систем). К сожалению, исследования генных сетей («молекулярных путей», или pathways), связывающих наследуемые/спорадические регулярные аномалии хромосом и/или вариации числа копий последовательностей ДНК (CNV) с хромосомной нестабильностью, крайне редки [4, 5]. Геномная архитектоника на молекулярном уровне (последовательность ДНК), по-видимому, играет определяющую роль в формировании различных вариаций генома. Серия исследований с использованием молекулярных, цитогеномных и биоинформатических методов показала, что структурные геномные варианты (хромосомные перестройки и CNV) часто возникают за счет процессов рекомбинации и репликации ДНК с участием повторяющихся некодирующих последовательностей ДНК, фланкирующих точки разрыва перестроек. На хромосомном или субхромосомном уровнях эти явления до настоящего времени систематически не рассматривались. Однако было показано, что ошибки сегрегации хромосом и непосредственно хромосомная патология формируют широкий спектр соматических перестроек генома [6-8]. В ходе предыдущих исследований геномных вариаций при нервно-психических заболеваниях нами был обнаружен особый тип хромосомной нестабильности и соматического мозаицизма, возникающий за счет регулярных геномных перестроек. Изучение данной формы хромосомной патологии позволило сделать вывод о том, что полногеномный и биоинформатический анализы структурных вариаций хромосом (регулярных и мозаичных) позволяют определять ранее неизвестные механизмы вариабельности соматического генома [7].

Целью настоящего исследования явилась оценка соответствующей формы хромосомной нестабильности и соматического мозаицизма с точки зрения молекулярных аспектов ее возникновения, вклада в этиологию заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) у детей и влияния на структурную организацию хромосомной ДНК.

Помимо этого, мы предлагаем цитогеномную теорию о роли специфических форм хромосомной нестабильности в патогенезе различных заболеваний и старении организма человека.

Материал и методы исследования

Молекулярное кариотипирование было выполнено для анализа хромосомных микроаномалий и CNV в российской когорте детей с заболеваниями ЦНС (такими как задержка психомоторного развития, умственная отсталость, аутизм, эпилепсия) и врожденными пороками (микроаномалиями) развития (n=705). Данная когорта была систематически описана в предыдущих исследованиях [7, 9]. SNP-array (молекулярное кариотипирование) выполнялось с помощью биочипов на платформе CytoScan HD Arrays (Affymetrix), включающих в себя примерно 2,7 млн ДНК-маркеров. Использованные методы были неоднократно и подробно описаны ранее [7, 10, 11]. Цитогеномные вариации визуализировали с помощью программного обеспечения Affymetrix ChAS (Chromosome Analysis Suite) (CytoScan® HD Array Version 4.1.0.90/r29400); версия референсного генома -- GRCh37/hg19.

Биоинформатический анализ осуществлялся по оригинальной технологии приоритизации CNV, генов-кандидатов и процессов-кандидатов с применением данных молекулярного кариотипирования. Фильтрация и ранжирование генов основываются на их онтологических параметрах, извлеченных из клинических, геномных, эпигенетических, протеомных/интерактомных и метаболических баз данных. Анализ генных сетей проводился с использованием концепции С^Увариома (совокупности всех СКУ, выявленных у каждого индивидуума) и протокола, который был подробно описан ранее [12-14]. Кроме того, определялось соотношение между размером регулярной и мозаичной хромосомной аномалии. Используя это соотношение, перестройки ранжировали по квартилям. «Насыщение» СКУ, изменяющее генные сети поддержания стабильности генома, определялось с помощью статистического Z-теста.

Это исследование было одобрено этическим комитетом ОСП «Научноисследовательский клинический институт педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева» ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Результаты исследования и их обсуждение

С помощью молекулярного кариотипирования российской когорты детей с заболеваниями ЦНС и врожденными пороками развития (п=705) было обнаружено, что сочетание регулярной и мозаичной перестройки в одном и том же хромосомном локусе (охватывающем аналогичные геномные области) выявляется у 57 пациентов (8,1%). Эти совместно локализованные структурные аномалии хромосом проявлялись в виде немозаичных делеций или дупликаций в сочетании с такой же мозаичной перестройкой, которая в основном была больше регулярной. Мы предположили, что совместное расположение этих форм аномалий генома не является случайным. Наблюдаемые изменения генома, скорее всего, представляли собой маркеры динамического процесса, который возникает из-за наличия регулярной перестройки хромосомы или С^У и распространяется посредством увеличивающегося с каждым делением клетки разрыва за счет потери или удвоения фланкирующих хромосомных локусов, приводя к образованию мозаичных вариаций. Фактически, регулярные структурные перестройки связаны с геномной нестабильностью в точках разрыва, которая приводит к более масштабной перестройке из-за нарушений репарации и репликации хромосомной ДНК. Согласно доступной биомедицинской литературе, подобной формы геномной/хромосомной нестабильности другими исследователями описано не было [7]. Обнаруженную форму нестабильности генома мы обозначили с помощью неологизма «хромохелкозис», что буквально означает «изъязвление хромосомы» (от древнегреч. «хромо», обозначающего хромосому, и «хелкоз» (еХко^), означающего образование и распространение язвы или изъязвление). Способ формирования предлагаемого термина соответствует способам, ранее используемым для обозначения других особых типов нестабильности генома, связанных с различной патологией (таких как врожденные пороки развития, онкологические заболевания): хромотрипсис («расщепление хромосом», характеризующееся обильным количеством перестроек и вариабельным числом копий последовательности ДНК), хромоанасинтез (локальное расщепление хромосом, связанное со случайной перестановкой хромосомных фрагментов) и хромоанагенез (сложные перестройки в одном/нескольких локусах, вызванные «катастрофическим» разрушением структуры хромосомы) [3, 8]. На рисунке 1 показаны примеры хромосомных перестроек, связанных с хромохелкозисом.

Рис. 1. Хромосомные перестройки, связанные с хромохелкозисом: (А) делеции в участке 15q13.2q13.3 (регулярная) и в участке 15q13.1q14 (мозаичная), (Б) дупликации в участке 16q23.1 (регулярная) и в участке 16q22.3q23.3 (мозаичная)

Обнаружено, что хромохелкозис выявляется в локусах всех хромосом, кроме 6, 8, 1821 и Y. Перестройки были представлены 30 дупликациями и 27 делециями (53/47). Максимальные размеры регулярных хромосомных аномалий достигали 21,5 млн пн, тогда как минимальный размер СКУ составил примерно 13 тыс. пн. Пять случаев хромохелкозиса были рекуррентными (неслучайные вариации в одних и тех же участках генома) (табл.). Это наблюдение позволило нам сделать вывод о том, что специфическая архитектура генома на уровне последовательности ДНК, вероятно, связана с хромохелкозисом.

Хромосомная локализация аномалий (делеций или дупликаций), ассоциированных с хромохелкозисом (п - число случаев)

Были также выявлены реципрокные перестройки хромосом, ассоциированные с хромохелкозисом (делеции и дупликации в одном и том же хромосомном/геномном районе), в участках 9р24.3, 9q34.13q34.3 и 15qП.2. Этот факт подтверждает предположение о том, что специфичность локальной геномной архитектуры делает отдельные локусы восприимчивыми к геномным/хромосомным перестройкам [6]. Однако для эффективного определения молекулярных основ хромохелкозиса потребовался дополнительный анализ, в ходе которого исследовались соотношения размеров регулярных и мозаичных хромосомных аномалий. По этому параметру случаи были разделены на квартили: Q1 - наименьшее соотношение или наибольшее расстояние между точками разрыва регулярной и мозаичной перестройки; Q4 - наибольшее соотношение или кратчайшее расстояние между точками разрыва регулярной и мозаичной перестройки. В результате было обнаружено исключительное преобладание аномалий с резко увеличенными размерами при мозаицизме (01). Таким образом, аномалии Q1 с большей вероятностью связаны с высокой степенью локальной нестабильности в точках разрыва и в пораженных хромосомных локусах.

При исследовании хромосомной локализации перестроек, ассоциированных с хромохелкозисом, было обнаружено, что он может быть связан с клиническими проявлениями (микро)делеционных и (микро)дупликационных синдромов за счет прогрессирующего разрыва структуры хромосомы. Среди таковых были микроделеционные и/или микродупликационные синдромы 1р36 (микроделеции и микродупликации), Ц21.1 (микроделеции и микродупликации), 10д22.3д23.2 (микроделеции), 13д33д34 (микроделеции), 14д32 (микродупликации), 15д13.3 (микроделеции), 15д14 (микроделеции), 17р13.3 (микродупликации), 22д11.2 (микроделеции и микродупликации), 22д13 (микродупликации), Хд21 (микроделеции) и Хд28 (микродупликации), а также синдромы терминальной делеции коротких плеч хромосом 3, 9, 11, Вильямса, Ангельмана, Прадера-Вилли и Миллера-Дикера. Важно отметить, что клинические проявления данных синдромов соответствовали в большей степени перестройкам, которые образовались за счет хромохелкозиса (мозаичным). Большинство из них были представлены стертой клинической картиной. Таким образом, корреляции кариотип - фенотип свидетельствуют о том, что хромохелкозис имеет значение для клинико-генетической характеристики детей с заболеваниями ЦНС, обусловленными хромосомной патологией, примерно в 8% случаев.

С использованием ранее предложенной модели анализа CNV в каждом индивидуальном геноме [14] и статистического Z-теста было проведено соответствующее исследование у детей с хромохелкозисом. Было обнаружено, что данная форма хромосомной нестабильности и соматического мозаицизма связана с увеличением числа CNV, затрагивающих гены, которые вовлечены в сети поддержания стабильности генома (репарация ДНК, запрограммированная гибель клеток, регуляция клеточного цикла) за счет, своего рода, «насыщения» С^У. Наблюдалась также корреляция между более высокой нагрузкой С^У и показателем прогрессирования хромохелкозиса.