Материал: И Занятие 6. Лабораторная диагностика иммунопатологических состояний у детей и взрослых

Иммунология. Занятие №6. Лабораторная диагностика иммунопатологических состояний у детей и взрослых

1. Лабораторная диагностика иммунопатологических состояний у детей и взрослых: методы, критерии оценки, интерпретация. _{вообще без понятия, что тут надо..}

Иммунодиагностика – раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, связанных с функцией иммунной системы.

Иммунный статус – структурное и функциональное состояние иммунной системы индивидуума, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей.

Иммунный статус показывает, способна ли в данный момент иммунная система к иммунному ответу.

2. Методы оценки иммунного статуса.

I. Общее клиническое обследование:

1. Жалобы пациента

2. сбор иммунологического анамнеза:

   Частота инфекционных заболеваний Характер течения заболеваний Выраженность температурной реакции Наличие очагов хронической инфекции Наличие признаков аллергизации

   Наследственная предрасположенность Профессиональные вредности Длительная терапия препаратами с иммуносупрессивными свойствами Принадлежность к группе риска Нарушение качества питания

3. Клиническое состояние

4. Оценка результатов клинического анализа крови:

• Содержание гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов

II. Состояние факторов неспецифической резистентности:

• Функциональная активность фагоцитов

• Оценка системы комплемента

• Содержание интерферона и лизоцима (если нужно)

III. Показатели гуморального иммунитета:

• Содержание Ig разных классов в сыворотке крови (по Манчини)

• Титр специфических антител (серологические реакции)

• Количество В-лимфоцитов в периферической крови (кластерный анализ, т.е. выявление специфических CD-молекул с помощью моноклональных антител)

• Бласттрансформация В-лимфоцитов (ответ на стимуляцию В-клеток митогенами*, например ЛПС-РБТЛ**)

*_{митогены – это вещества, стимулирующие митоз, **РБТЛ- реакция бласттрансформации}

IV. Показатели клеточного иммунитета:

• Число Т-лимфоцитов и их субпопуляций

• Бласттрансформация Т-лимфоцитов (ответ на стимуляцию Т-клеток митогенами – конканавалином А или фитогемагглютинином)

• Уровень гормонов тимуса и цитокинов, секретируемых Т-лимфоцитами (ИФА с моноклональными антителами)

+ Дополнительные тесты:

• Бактерицидность сыворотки крови

• Число С3 и С4 (это компоненты комплемента)

• Содержание ревматоидных факторов и др. аутоантител и т.д.

Определение количества Т-лимфоцитов:

Принцип метода:

1 этап. Центрифугирование => выделение лимфоцитов

2 этап. Реакция розеткообразования с эритроцитами барана => определение процента Т-лимфоцитов среди всех лимфоцитов

П ри добавлении к суспензии эритроциты барана адсорбируются на Т-лимфоцитов за счёт наличия на них рецепторов, фиксирующих эритроциты барана. Образуются розетки. Под микроскопом считают число розеток и общее количество лимфоцитов.

Определение количества В-лимфоцитов методом розеткообразования

Принцип метода аналогичен. Разница лишь в том, что используются эритроциты мыши, а не барана.

Оценка способности к пролиферации в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

П ринцип метода: Т-лимфоциты под воздействием митогенов, например, фитогемагглютинина (ФГА,) в культуре in vitro способны превращаться в большииие бластоподобные клетки с разрыхленным ядром и базофильной цитоплазмой, активно синтезирующие ДНК.

Определение концентрации иммуноглобулинов в реакции преципитации по Манчини

Принцип метода: образцы исследуемой сыворотки помещают в лунки

агаров геля, который содержит антитела против Ig определенного класса.

• Иммуноглобулины, диффундируют в агар.

• П ри взаимодействии с соответствующими антителами Ig образуют кольца преципитата

• Диаметр колец тем больше, чем выше концентрация Ig соответствующего класса в исследуемой сыворотке.

• Концентрацию иммуноглобулина определяют по калибровочной кривой (по заранее построенному с помощью эталонных сывороток графику).

Методы выявления сенсибилизации in vitro

Определение количества IgЕ определенной специфичности или их общего

количества с помощью радиоиммунного или иммуноферментного методов.

РЕАКЦИЯ ДЕГРАНУЛЯЦИИ.

Принцип метода: при фиксации комплексов аллерген+Ат на наружных мембранах клеток-мишеней (базофилов, нейтрофилов) наблюдается

их повреждение. На их поверхности появляется «корона» из гранул, которые

можно выявить при микроскопии. Степень дегрануляции соответствует степени сенсибилизации.

Показатель повреждения нейтрофилов (ППН)

Принцип метода: под действием аллергена снижается подвижность нейтрофилов.

15. Наиболее распространённых методов оценки иммунного статуса:

1. Общий анализ крови;

определение соотношения нейтрофилы/лимфоциты/моноциты;

СОЭ, СРБ (С-реактивный белок)

белковые фракции сыворотки крови (γ-глобулины).

2. Определение количества Т-лимфоцитов (процент и абсолютное число)

методами с моноклональными антителами (мАТ)

антителами к CD2, CD3,CD4, CD8, CD25

отношения CD4/CD8.

3. Определение В-лимфоцитов — CD19, CD21, CD22, CD72 или Ig+B.

4. Определение иммуноглобулинов классов G, М, А, Е в сыворотке крови и sIgA в

слюне. Соотношения их количества (G/M/A).

5. Поглотительная активность нейтрофилов крови, частиц латекса и/или стафилококков, кандид (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс);

оценка киллинга кандид, бактерий.

6. НСТ-тест (показатель бактерицидности нейтрофилов)

7. Определение циркулирующих иммунных комплексов (методом ПЭГ-

осаждения). Другие тесты по показаниям.

8. Антитела против стрептококка, дифтерийного токсина, гемофильной палочки,

столбнячного токсина, стафилококка, его токсина и вирусов (кори, гриппа).

9. Определение гемолитической активности комплемента и/или его компонентов.

10. Внутрикожные пробы (после забора крови!) с распространенными антигенами

(туберкулин, стрептокиназа-стрептодерназа, антигены бактерий и грибов).

11. По показаниям – определение ферментов, отсутствующих при первичных иммунодефицитах

(аденозиндезаминаза АДА, пуриннуклеозидфосфорилазы, альфафетопротеин при

атаксии; гранулы лейкоцитов при гранулематозной болезни).

12. Оценка интерферонового статуса:

концентрация интерферона в сыворотке крови;

уровень интерферона-и в культуре лимфоцитов крови после стимуляции

вирусом болезни Ньюкастла и стафилококковым энтеротоксином

соответственно.

13. HLA-типирование (при необходимости). _{HLA-главный комплекс гистосовместимости}

14. Выявление цитокинов (по показаниям), в крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в клетках системы иммунитета (СИ) методами проточной

цитометрии.

15. Определение общей g-цепи рецепторов цитокинов при тяжелом комбинированном иммунодефиците (ТКИД) методом проточной цитометрии.

3. Уровни оценки иммунного статуса

I этап. Клинический, ориентировочный

• иммунологический анамнез

• клинический анализ крови

• выявление бактерионосительства

II этап. Иммунологический анализ крови – иммунограмма.

Иммунограмма включает тесты I и II уровней:

I уровень. Выявление дефекта иммунной системы

• клинический анализ:

Определение относительного и абсолютного кол-ва лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, тромбоцитов периферической крови.

• б/х анализ крови: уровень γ-глобулинов в протеинограмме

• гуморальный и.: концентрация сывороточных IgA, M, G

• клеточный и.: определение относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, NK

• Опр. функциональной активности фагоцитов (HCT-тест)

• Опр. гемолитической активности комплемента

II уровень Уточнение характера дефекта, выявленного тестами первого уровня*.

*Тесты 2 уровня выполняют не по списку, а избирательно для выявления и уточнения уровня иммунопатологии.

• определение функц. активности субпопуляций лимфоцитов – РБТЛ

• цитотоксичности

• уровня цитокинов

• концентрации компонентов комплемента в сыворотке крови (с3, с4, с5, с1)

• субпопуляций лимфоцитов СD3, CD4, CD8, CD16 и др.

• оценка различных этапов фагоцитоза

• опр. подклассов Ig

• определение ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов)

• исследование интерферонового статуса

• кожные пробы