Автореферат
диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук
14.01.04 - внутренние болезни
Информированность протеомного профилирования в прогнозе течения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни
Смирнова Елизавета Александровна
Ростов-на-Дону - 2018
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научный руководитель:
· Тарасова Галина Николаевна доктор медицинских наук, профессор.
Официальные оппоненты:
· Корочанская Наталья Всеволодовна, доктор медицинских наук, профессор, федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры хирургии № 3 ФПК и ППС, руководитель гастроэнтерологического центра Краевой клинической больницы № 2, главный внештатный гастроэнтеролог Министерства здравоохранения Краснодарского края и Южного Федерального округа;
· Бордин Дмитрий Станиславович, доктор медицинских наук, доцент, государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Московский клинический научно-практический центр имени А.С. Логинова Департамента здравоохранения г. Москвы», заведующий отделом патологии поджелудочной железы, желчных путей и верхних отделов пищеварительного тракта, профессор кафедры общей врачебной практики (семейной медицины) ФДПО, интернатуры и ординатуры ФГБОУ ВО «Тверской государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, главный внештатный специалист гастроэнтеролог Департамента здравоохранения города Москвы.
Ведущая организация: федеральное государственное бюджетное учреждение дополнительного профессионального образования «Центральная государственная медицинская академия» Управления делами Президента Российской Федерации (ФГБУ ДПО «ЦГМА» УД Президента РФ).
Общая характеристика работы
Актуальность темы и степень ее разработанности
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в диагностике и терапии кислотозависимых заболеваний, работы, посвященные гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ), сохраняют свою актуальность ввиду растущей распространенности, рефрактерности на фоне кислотосупрессивной терапии и высоких рисков осложненного течения заболевания [Бордин, Д.С., 2011; Морозов, С.В., 2010; Корочанская, Н.В., 2016; El-Serag, H.В., 2014; Gad El-Hak, N.A., 2007; Havemann, B.D., 2007; Herbella, F.A., 2015]. Так, по данным систематического обзора, посвященного эпидемиологии ГЭРБ, отмечается рост распространенности заболевания с 1995 года, особенно в странах Северной Америки и Восточной Азии [El-Serag, H. B., 2014]. Результаты исследования Frazzoni L. et al. (2017) указывают на первостепенный вклад прогрессирования ГЭРБ в пищевод Барретта (ПБ), резистентности к терапии ингибиторами протонной помпы (ИПП), составляющей около 30% [Frazzoni, L., 2017]. На сегодняшний день известно, что ПБ является факультативным предраковым состоянием, увеличивающим риск развития аденокарциномы пищевода (АКП) в 30-125 раз по сравнению с общей популяцией, при этом вероятность злокачественной трансформации ПБ варьирует в пределах 0,5-2,1% [Desai, T.K., 2011; Rubenstein, J.H., 2014; Terry, P., 2000]. В соответствии с современными представлениями ГЭРБ является полиэтиологичным заболеванием со сложным патогенезом, включающим повреждающее действие рефлюктата, нарушения моторики на уровне пищевода и желудка, а также измененную чувствительность слизистой оболочки (СО) пищевода [Бордин, Д.С., 2012; Ивашкин, В.Т., 2010; Biljana, J., 2016; McQuard, K.R., 2011; Pawlik, M.W., 2014]. Кроме этого, в ряде исследований подчеркивается роль изменений белковой экспрессии при разных формах ГЭРБ и градациях рефлюкс-эзофагита (РЭ) [Колесов, С.А., 2014; Breton, J., 2008; Calabrese, C., 2011; Liu, N., 2013; Zhao, J., 2007]. В связи с растущими возможностями современных методологических подходов молекулярной медицины представляют интерес работы с использованием постгеномных технологий, позволяющих выяснить ранее неизвестные механизмы развития целого ряда заболеваний. Установлено, что большинство патологических изменений в клетках и тканях отдельных органов характеризуются отклонением от физиологического белкового профиля организма здорового человека. Идентификация выявленных белков с помощью современных биоинформационных подходов, изучение их физиологических функций, а также анализ изменений при различных заболеваниях и ответ на проводимую терапию являются основными задачами протеомики. Кроме того, методы сравнительной протеомики позволяют выявить белковые предикторы заболевания и новые «мишени» для таргетной терапии. При ГЭРБ, в целом, картина изменений в протеоме СО пищевода остается малоизученной, хотя потребность в дополнительных молекулярных маркерах, которые могли бы фактически отражать ее состояние и определять объективный прогноз развития заболевания, высока [Calabrese, С., 2011; Shao-Bin, Y., 2017; Zhao, J., 2015]. В представленных работах получены довольно разнородные и противоречивые данные о белковом паттерне у пациентов с осложненным течением заболевания - ПБ, что не позволяет сделать выводы о динамике изменений белкового профиля у пациентов с разными формами ГЭРБ и градациями РЭ.
Таким образом, широкая распространенность, большая социально-экономическая значимость заболевания диктуют необходимость дальнейшего изучения патогенетических механизмов развития ГЭРБ и оптимизации ее диагностики, используя для этого постгеномные технологии.
Цель исследования
Установление клинико-патогенетического и диагностического значения протеомного дисбаланса в слизистой оболочке пищевода при ГЭРБ.
Задачи исследования
1. Охарактеризовать протеомный профиль СО пищевода у здоровых лиц.
2. Изучить протеомный профиль СО пищевода при разных формах ГЭРБ и градациях РЭ.
3. Сопоставить протеомный профиль СО пищевода при неосложненном и осложненном течении заболевания - ПБ.
4. Провести морфофункциональную оценку состояния эпителия и собственной пластинки СО пищевода у больных с тяжелым и осложненным течением ГЭРБ, определив характер экспрессии молекул клеточной адгезии - Е-кадгерина.
5. Определить патогенетическую роль выявленных протеомных маркеров в развитии ГЭРБ и оценить их диагностическую (прогностическую) значимость в предикции характера течения болезни.
Научная новизна
Впервые выявлены и проанализированы в сравнительном аспекте специфические особенности протеомного спектра СО пищевода при ГЭРБ в зависимости от преобладающего характера рефлюктата.
Впервые в качестве диагностических маркеров развития ПБ предложен белковый паттерн, представленный статмином 1, тиоредоксином, белком теплового шока 60-kDa, элонгационным фактором Tu, инорганической пирофосфатазой. Полученные результаты углубляют представления о молекулярных механизмах развития тяжелого и осложненного течения ГЭРБ.
Впервые установлено, что экспрессия Е-кадгерина при ГЭРБ, имеющая однонаправленную динамику изменений в зависимости от градации РЭ и характера рефлюктата, может служить потенциальным фактором прогнозирования тяжести течения заболевания.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Расширены теоретические представления о механизмах формирования повреждения СО пищевода при ГЭРБ и ее прогрессировании. Установлены белковые композиции в СО пищевода, характеризующие разные градации РЭ. Определен белковый паттерн СО пищевода при осложненном варианте течения заболевания - ПБ. Биоинформационными методами проанализированы и реконструированы специфичные межбелковые взаимодействия при ГЭРБ, а также патобиохимические пути развития патологии пищевода на уровне клетки с участием обнаруженных в исследовании белков.
Материалы и результаты исследования применяются в учебном процессе на кафедре пропедевтики внутренних болезней, факультете повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов РостГМУ (кафедра гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии ФПК и ППС). Результаты работы внедрены в практику отделения гастроэнтерологического клиники РостГМУ, гастроэнтерологической службы МБУЗ ГБ № 8 г. Ростова-на-Дону.
Методология и методы исследования
Диссертационная работа является прикладным научным исследованием, основанном на общенаучных подходах и решающим проблему расширения представлений о патогенетических механизмах развития и прогрессирования ГЭРБ. Объект исследования: пациенты с разными формами ГЭРБ и градациями РЭ, а также с осложненным течением заболевания - ПБ.
Все больные были обследованы в соответствии с Национальными рекомендациями по диагностике и лечению ГЭРБ (2017). Диагноз ГЭРБ верифицирован с использованием клинико-анамнестических данных, результатов тестового опросника GerdQ, инструментальных методов обследования: видеоэзофагогастродуоденоскопии с детальным осмотром дистального отдела пищевода (режим NBI), хромовидеоэзофагоскопии с витальным красителем (4% раствор Люголя), биопсией и морфологическим исследованием эзофагобиоптатов; 24-часовой внутрипищеводной pH-импедансометрии; рентгеноскопии пищевода и желудка с дополнительными нагрузочными тестами (Вальсальва, Тредленбурга).
Предварительное фракционирование образцов СО пищевода выполняли с использованием магнитных микрочастиц с различными поверхностями (MB-HIC C8, MB-IMAC Cu, MB-WСХ), согласно методике производителя (Bruker Daltonics, Германия). Профилирование протеома проводили на времяпролетном тандемном MALDI-масс-спектрометре Ultraflex II. Каждый масс-спектр был проанализирован с помощью программ FlexAnalysis 3.0 и ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Идентификацию белков и пептидов проводили с помощью баз данных NCBI и SwissProt / UniProt с использованием программы Mascot Search (v2.1, Matrix Science, Великобритания). Результаты идентификации белков принимались как достоверные при уровне значимости не менее 95% и показателе сиквенс-покрытия не менее 60%.
Иммуногистохимическое исследование эзофагобиоптатов проводилось стрептавидин-биотиновым методом с использованием моноклональных мышиных антител к Е-кадгерину (Dako, США). Экспрессия Е-кадгерина оценивалась полуколичественным методом от 0 до 3 баллов (+++) в покровном эпителии кардиального отдела, многослойном плоском эпителии, в железах и в зонах кишечной метаплазии. Количественно изучаемый маркер измерялся в условных единицах оптической плотности (УЕОП) с помощью аппаратно-программного комплекса - инвертированного микроскопа Leica DM108 и моторизованного микроскопа Leica DM6000 в программе Leica Applicationsuite Version 4.6.
Статистический анализ данных проводился средствами встроенного прикладного пакета модулей программы «STATISTICA 10.0 for Windows» (StatSoft, USA).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Использование сравнительного протеомного и биоинформационного анализа позволяет выявить белки, ассоциированные с ГЭРБ и развитием ее осложненного течения.
2. Разные градации РЭ отличаются протеомным спектром СО пищевода и характеризуются как появлением дополнительных белков отличия, так и отсутствием ряда белков по сравнению с неизмененной тканью пищевода.
3. Белковый паттерн, идентифицированный для ПБ, позволяет использовать его в качестве прогностического маркера формирования осложненного течения ГЭРБ.
4. Характер рефлюктата влияет на модификацию протеомного спектра СО пищевода и молекулы клеточной адгезии - Е-кадгерина, что создает предпосылки для внесения дополнений в протоколы терапии ГЭРБ.
Степень достоверности результатов
Обоснованность и статистическая значимость полученных результатов обеспечена достаточным объемом выборки для клинико-инструментальной и морфологической верификации диагноза и оценки течения ГЭРБ, использованием современных постгеномных методик, применением адекватных методов математической обработки полученных результатов.
Личное участие автора
Личное участие автора осуществлялось на всех этапах выполнения настоящего исследования и включало отбор пациентов и проведение их клинического обследования, первичную обработку и систематизацию полученного материала, статистический анализ результатов и их введение в научный оборот путем написания статей в профильных журналах и выступлений на научно-практических конференциях, разработку «Способа диагностики пищевода Барретта у больных с осложненным течением гастроэзофагеальной рефлюксной болезни» и внедрение его в клиническую практику.
Апробация результатов исследования и публикации
Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедры пропедевтики внутренних болезней и научно-координационного совета «Научно-организационные основы профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний внутренних органов» ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России (протокол № 8 от 30.08.2018 г.).
Основные положения диссертации представлены на IV,VI Межрегиональной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Интернист» (Ростов-на-Дону, 2015, 2017), 21-ой объединенной Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2015), IV Съезде терапевтов Южного Федерального округа (Ростов-на-Дону, 2015), Третьей итоговой научной сессии РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2016), VII Латвийском гастроэнтерологическом конгрессе с международным участием (Рига, 2016), 22-ой объединенной Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2016), Четвертой итоговой научной сессии РостГМУ (Ростов-на-Дону, 2017), VIII Латвийском гастроэнтерологическом конгрессе с международным участием (Рига, 2017). По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 4 журнальные статьи в изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации. Получен патент на изобретение № 2655807 «Способ диагностики пищевода Барретта у больных с осложненным течением гастроэзофагеальной рефлюксной болезни».
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц, иллюстрирована 18 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, приложения. Указатель литературы включает в себя 327 источников, из них 62 отечественных и 265 зарубежных.
Основное содержание работы
Клиническая характеристика обследованных больных
В исследование включено 145 пациентов с ГЭРБ (89 - женщин и 59 - мужчин), в возрасте 19-75 лет (средний возраст 48±14,2 лет) и 15 пациентов с ПБ (5 - женщин и 15 - мужчин), средний возраст 46,2±15 лет. Критериями включения в протокол исследования являлись: амбулаторные и стационарные больные с диагнозом ГЭРБ и ПБ, в возрасте от 16 до 75 лет, обоего пола, подписавшие информированное согласие для участия в клиническом исследовании. Критериями исключения из проводимого исследования служили: беременные, кормящие грудью женщины; наличие злокачественных новообразований разной локализации в настоящее время или в анамнезе; клинически значимые отклонения клинических и лабораторных показателей от нормы, выраженная органическая патология печени, легких, почек; заболевания сердечно-сосудистой системы, включая верифицируемую ЭКГ маркерами ишемическую болезнь сердца; отказавшиеся от дополнительного обследования, входящего в протокол исследования. Протокол исследования одобрен локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.
Ранжирование больных с разными формами ГЭРБ на группы проводилось в соответствии с классификацией Савари-Миллер, при выявлении ЭЭ - Лос-Анджелесской классификацией [Dent, J., 2008]. На основании комплексного обследования больных было сформировано 4 группы. I группа - 52 больных с неэрозивной формой рефлюксной болезни (НЭРБ) и 39 пациентов с катаральным эзофагитом (КЭ), II (средне-тяжелые формы заболевания) - с градацией РЭ А и В (20 и 15 пациентов соответственно), III - 14 пациентов с градацией РЭ С и 5 пациентов с градацией РЭ D, IV (осложнённое течение) - 15 пациентов с ПБ. Контрольную группу составили 20 практически здоровых добровольцев.
Результаты и обсуждение
Белковый паттерн слизистой оболочки пищевода в группе контроля и у пациентов с ГЭРБ
В настоящем исследовании изучены белковые композиции и вариабельность протеома СО пищевода у 45 пациентов с ГЭРБ и в группе 20 здоровых добровольцев. В качестве материала для исследования был выбран сегмент пищевода с максимально выраженными воспалительными изменениями СО. Изучению подвергались белки, экспрессируемые с частотой более 60%, а также редко встречающиеся белки, специфичные для изучаемых групп. В ходе исследования был идентифицирован 61 белок, для 57 из них определена тканевая принадлежность. Из числа идентифицированных белков в группе добровольцев тканевая принадлежность к пищеводу выявлена для 4-х: в их числе корнулин, муцин 21, 22, кальпаин 14, играющих ключевую роль в поддержании функции преэпителиального и эпителиального барьера СО пищевода [Contzler, R, 2005; Yilchi, I.,2008]. Также, в этой группе были идентифицированы 11 часто экспрессирующихся белков, преимущественно локализованных во внутриклеточном пространстве: муцин 21, 22, кератин 6С тип 2, кальпаин 14, кератин 4 тип 2, кератин 13 тип 1, корнулин, транглутаминазы 1, 3, инсулиноподобный фактор роста 1, пролин обогащенный белок 1б (табл. 1).