Статья: Изучение сенсибилизирующих и патогенных свойств L-форм микобактерий

Изучение сенсебилизирующих и патогенных свойств L-форм микобактерий

Е.В. Тарасова А.М. Коваленко

Туберкулез является антропозоонозом, поэтому представляет мировую проблему, несмотря на значительные успехи, достигнутые в различных областях биологических наук. Для прижизненной диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных в данное время основным, массовым методом в ветеринарной практике является внутрикожная туберкулиновая проба с применением ППД - туберкулин для млекопитающих. Однако не редко выявляют положительно реагирующих на туберкулин животных в благополучных по туберкулезу хозяйствах - это так называемые неспецифические или параалергические реакции на туберкулин. Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год; так в настоящее время в благополучных хозяйствах выявляется в 5,3 раз больше реагировавших животных, чем в благополучных по туберкулезу хозяйствах [А.Х. Найманов, Н.П. Овдиенко, 2003]. Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества реагирующих здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает обоснованные сомнения достоверности туберкулиново диагностической пробы. Известно, что причиной неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота является не только микобактерии туберкулеза, но и многие условно патогенные и сапрофитные микобактерии. Рецедивы возникновения туберкулеза у людей связывают с персистированием в организме возбудителя в L-форме[Келимжанова Б.Ф., 1991 - 1998гг., Дорожкова И.Р., Голышевская, 1995гг.].

Вместе с тем, выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала связано с определенными трудностями в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя. Основные из них, - медленный рост на питательных средах и способность к L-трансформации. Исследования ряда авторов [Урбан В.П.1990, Федосеев В.С., 1985,. Герман М.И., 1988] дают основание предположить, что одной из причин длительного неблагополучия хозяйств по туберкулёзу крупного рогатого скота может быть латентный микробизм, обусловленный персистенцией микобактерий туберкулёза в L-форме [3].

Длительная персистенция возбудителя в измененной деструктивной по клеточной стенке форме, а так же L-трансформация микобактерий может происходить под воздействием самых различных факторов внешней среды[1], длительное применение антибактериальных препаратов и воздействие на клеточную стенку микобактерий. (В.Г. Ощепков с соавт., 2001, 2003 и др.). В то же время отсутствие достаточных знаний об условиях образования L-форм и методов выделения не позволяет оценить их значение в течении эпизоотического процесса при туберкулезе КРС.

Целью наших исследований было изучить биологические свойства L-форм возбудителя туберкулеза в опытах на морских свинках.

Материалы и методы. Биологические свойства изолированных из патологического материала выделенных от крупного рогатого скота L-форм микобактерий изучали в опытах на клинически здоровых морских свинках, которые до начала эксперимента не реагировали на внутрикожное введение ППД - туберкулина для млекопитающих.

Заражение животных проводили стабильными и нестабильными культурами в L-форм, выращенных на среде Школьниковой. Приготовленную взвесь L-форме на стерильном физиологическом растворе вводили во выстриженную область бедра задней конечности морским свинкам внутримышечно в дозе 1 смі. Опытных животных трехкратно с интервалом 30 дней исследовали аллергическим методом на туберкулез. Через 90 дней после начала эксперимента всех животных подвергали эвтаназии и патологоанатомическому исследованию на туберкулез. Отобранный биологический материал от морских свинок исследовали культуральным методом на наличие R, S и L-форм микобактерий.

Предпосевную обработку патологического материала с целью выделения L-форм микобактерий проводили по методу Аликаевой (1940 гг.) с применением 3 % р-р серной кислоты. Полученную взвесь фильтровали через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм., и высевали на среду Школьниковой. Для выделения бактериальных форм (R, S) полученную взвесь высевали на плотную яичную среду Левенштейна - Инсена. Пробирки с посевами помещали в термостате при температуре (37±0,5?С). Учет роста колоний из патологического материала проводили через каждые 5-7 суток на протяжении 3-х месяцев.

Из выросших колоний микобактерий, готовили мазки, которые окрашивали по методу Циля - Нильсена и подвергали световой микроскопии. Выросшие на среде Школьниковой в толще среды облакоподобные помутнения, исследовали методом фазово - контрастной микроскопии.

Результаты исследований. Результаты изучения сенсибилизирующих свойств изолированных, из патологического материала от крупного рогатого скота L-форм микобактерий в опытах на морских свинках представлены в таблице 1.

Приведенные в таблице 1 данные свидетельствуют о том что, при аллергическом исследовании морских свинок зараженных культурой № 4 и № 7, установлено на 30 день реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих была выявлена только в четырёх животных. Через 60, 90 день с начала эксперимента реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих была выявлена в 13 морских свинок из 18 зараженных культурами №№ 1, 2, 3, 7, 8, 10.

Характер реакции был различным, от незначительного воспалительного отека. В морских свинок зараженных культурами стабильных L-форм микобактерий положительную реакцию на туберкулин (ППД) для млекопитающих вызывала культура № 4 и №5 у троих животных из шести, а на 90 день от начала эксперимента у 7 морских свинок.

Таблица 1. Результаты сенсибилизирующих свойств лабораторных животных зараженных L-формами микобактерий выделенными от крупного рогатого скота.

Животные контрольной группы, - зараженные референтным штаммом Vallee морские свинки, реагировали во все сроки исследования. При этом реакция на туберкулин (ППД) для млекопитающих характеризовалась ярко выраженными воспалительными отеками.

Патогенныйе свойства L-форм микобактерий испытывали на тех же морских свинках и кроликах, на которых изучали их сенсибилизирующие свойства. Результаты патологоанатомического исследования представлены в таблице 2.

сенсибилизирующий патогенный микобактерия туберкулез

Таблица 2. Изучение патогенных свойств, выделенных L-форм микобактерий, от крупного рогатого скота.

Как свидетельствуют материалы, приведенные в таблице 2, при патологоанатомическом исследовании через 90 дней после начала эксперимента характерные для туберкулеза изменения в лимфатических узлах и единичные туберкулы в печени были выявлены, у 12 морских свинок зараженных нестабильными L-формами микобактерий №№ 1, 2, 3, 7. Из 18 морских свинок зараженных нестабильными L-формами микобактерий пало пять животных на 75 день. В морских свинок, которые были заражены, стабильными L-формами микобактерий (№№ 4, 5, 6, 9) при вскрытии только в четырех голов было выявлены увеличение левого пахового лимфатического узла в 2-3 раза, а в остальных 11 животных изменений характерных для туберкулеза не выявлено.

Однако патологические изменения у морских свинок были менее выражены в сравнении с контрольной группой животных, зараженных культурой референтного штамма Vallee.

При культуральном исследовании отобранного патологического материала от морских свинок зараженных нестабильными L-формами микобактерий выделено четыре культуры в бактериальной форме (R -форме), а также девять культур в L-форме микобактерий. Первичный рост колоний в R-форме на яичной питательной среде для культивирования микобактерий отмечали на 28±1,8 сутки после посева, при этом интенсивность роста была не одинаковой. При микроскопии мазков, окрашенных по методу Циль-Нильсена, в поле зрения обнаруживали короткие кислотоустойчивые палочки. На основании биохимических и биологических свойств изолированные культуры были отнесены от морских свинок к M. bovis.

У морских свинок, которые были заражены стабильными L-формами, культуры в бактериальной форме не было выделено, тогда, как первичный рост на среде Школьниковой был отмечен на 18±0,3 день в L-форме от экспериментально зараженных животных культурой №№ 4, 5, 6. При фазово-контрастной микроскопии мазков из выросших культур были обнаружены шаровидные образования различной величины.

Вывод. Культуры в L - форме микобактерий обладали сенсибилизирующими и патогенными свойствами для лабораторных животных.

Литература

1. Козлов В.С. Биологические свойства микобактерий различных видов, выделенных из почвы / Козлов В.С. // Проблемы туберкулёза. - 1982. - № 3. - С. 65-68.

2. Рубцова И.Н. Измененные формы микобактерий в организме животных и их значение в бактериологической диагностике туберкулеза. / Рубцова И.Н. // Бюллетень ВИЭВ. - 1983. - Вып. 51. - М. - С. 32.

3. Герман М.И. Биологические свойства L-форм Mycobacterium bovis: автореф. дис… канд. вет. наук: 16.00.03 / М.И. Герман; [Всесоюзный ордена Ленина НИИЭВ имени Я.Р. Коваленко]. - М., 1988. - 20 с.

4. Драбкина Р.О. Микробиология туберкулёза. - М.: Медгиз, 1963. - 254.