Занятие 22 Тема: «Возбудители дифтерии, коклюша и паракоклюша»
Классификация. Возбудит дифтерии относится к отделу Firmicutes, семейству Corynebacteriaceae, роду Corynebacterium, виду C. diphtheriae. Название микроба происходит от греч. coryne - булава, bacteria - палочка, diphtheria - пленка.
Морфология. С. diphtheriae (палочка Клебса-Лёффлера) - прямые или слегка изогнутые неподвижные грам+ палочки. Спор и капсул не образуют. Палочки утолщены на концах и напоминают булаву. В мазках бактерии располагаются под углом друг к другу, в виде “растопыренных пальцев”, “иероглифов”, “паркета”, латинских букв V, Y, L и др. На поверхности бактерий имеются фимбрии, облегчающие адгезию к эпителию слизистой оболочки.
Культуральные свойства. Дифтерийная палочка явл аэробом или факультативным анаэробом, температурный оптимум для роста 35-37°С, оптимальная рН 7,6-7,8. Лучше растет на средах, содержащих кровь или сыворотку крови животных, хорошо растет на средах с теллуритом калия. В бульоне наблюдается равномерное помутнение или нежная пленка.
Элективные среды для выращивания C. diphtheriae: -свернутая кровяная сыворотка (среда Ру);
-сыворотка с добавлением сахарного бульона (среда Ру-Лёффлера);
-кровяной агар (КА);
-кровяной теллуритовый агар (среда Клауберга II);
-хинозольная среда Бучина;
-цистин-теллурит-сывороточная среда Тинсдаля-Садыковой.
2. Возбуд дифт: токсинообразование. Методы выявл токсигенности. Что происходит с токсином под действием формалина и тепла?
Токсинообразование. Corynebacterium diphtheriae продуцирует мощный экзотоксин — основной фактор патогенности. Нетоксигенные штаммы дифтерии не вызывают развитие заболевания.
Основные фракции дифтерийного токсина 4 фракции: 1Гистотоксин 2 «Истинный токсин»
3 Гиалуронидаза 4 Гемолизин
Антиген св-ва. О-антигены – термостабил полисахаридные, распол в глубине клет стенки. К-антигены – поверхностные, термолабильные, серовароспецифические. С помощью сывороток к К-антигену С.diph. разделяют на серовары.
Факторы патогенности. Экзотоксин, нарушающий синтез белка и поражающий в связи с этим кл миокарда, надпочечников, почек, нерв ганглиев. Ферменты агрессии — гиалуронидазу, нейраминидазу. К факторам патогенности относится также микрокапсула.
Методы выявления токсигенности Для обнаружения токсигенности дифтерийных бактерий можно испол след способы: 1. Биологические пробы на животных. Внутрикожное заражение морских свинок фильтратом бульонной культуры дифтерийных бактерий вызывает у них некроз в месте введения.
2. Заражение куриных эмбрионов. Дифтерийный токсин вызывает их гибель.
3. Заражение культур клеток. Дифтерийный токсин вызывает отчетливый цитопатический эффект.
4. Метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием меченных пероксидазой антитоксинов.
5. Использование ДНК-зонда для непосредственного обнаружения Юх-оперона в хромосоме дифтерийных бактерий.
6. Обнаружение гена токсигенности (tox) методом ПЦР – наиб быстрый и надежный метод лаб диагн, однако он не дает информацию о способности микроорганизма к экспрессии дифтерийного токсина.
Однако наиб простым и распростр способом опред токсигенности дифтерийных бактерий явл серологический – метод преципитации в геле. Суть: Полоску стерильной фильтровальной бумаги размером 1,5 х 8 см смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 500 АЕ в 1 мл, и наносят на поверхность пит. среды в чашке Петри. Чашку подсушивают в термостате 15—20 мин.
Испытуемые культуры засевают бляшками по обе стороны от бумажки. На 1 чашку засевают несколько штаммов, 1 из кот, заведомо токсигенный, служит контролем. Чашки с посевами инкубируют при 37 °С, результаты учитывают через 24—48 ч. Вследствие встречной диффузии в геле антитоксина и токсина в месте их взаимодействия образуется четкая линия преципитации, кот сливается с линией преципитации контрольного токсигенного штамма. Полоски неспецифической преципитации (они образуются, если в сыворотке кроме антитоксина присутст в небольшом кол-ве др антимикробные антитела) появл поздно, выражены слабо и никогда не сливаются с полоской преципитации контрольного штамма.
Район Рамон установил, что при воздействии формалина и тепла на дифтерийный токсин образуется обезвреженное соед, обладающее антигенными и иммуногенными св-вами. Изучая р-цию флоккуляции дифтерийного токсина с антитоксином, он применял формалин как антисептик для сохр токсина. Добавл формалина к токсину не препятствовало появл феномена флоккуляции, даже если этот токсин подвергался действию умеренного тепла в термостате. Не влияя на способность токсина флоккулировать, формалин резко снижал его токсические св-ва, как и ряд др хим и физ св-в. Р-ция флоккуляции токсинов с антитоксинами сыграла большую роль в разработке метода приготовления анатоксинов.
Источник инфекции Заболевший любой формой дифтерии и носитель токсигенных C. diphtheriae.
Механизм заражения Воздушно-капельный (при чихании, кашле, в разговоре), контактно-бытовой (через загрязнённые коринебактериями поверхности).
Клинические прояления Признаки дифтерии у детей и взрослых в 1ые дни болезни неспецифичны и напоминают ангину, поэтому при их появлении необходимо вызвать врача на дом. Обращают внимание на такие признаки:
· плотная светлая пленка на миндалинах, плохо снимающаяся шпателем;
· поражение двустороннее, но размеры его неодинаковы справа и слева;
· незначительное покраснение и боль в горле;
· температура снижается уже через 2 – 3 дня, тогда как налеты в горле сохраняются намного дольше;
· возможен отек шеи;
· после использования противодифтерийной сыворотки все симптомы быстро ослабевают.
При любом воспалении миндалин необходим мазок на дифтерию из зева и носовой полости.
Для получения быстрого результата проводят анализ на дифтерию методом ПЦР, используют и бактериологическое исследование полученного материала. Также диагностика дифтерии включает определение антител к токсину бактерии.
4. Возбудит дифт: материалы для микробиолог исслед, на какие среды засевают? По каким признакам идентифицируют палочки дифтерии?
Исследуемый материал: дифтеритические пленки, мокрота, кровь, мазки из зева, носоглотки, отделяемое пораженных кожных покровов и др. Воздудитель выделяется у реконвалесцентов в течение 15-20 дней
1). Бактериоскопический метод – окраска по Граму, Леффлеру, Нейссеру (зерна Бабеша-Эрнста)
2) Бактериологический метод – посев клеток пациента на среду Клауберга с теллуритом, постановка пробы Пизу (образется коричневое облачко), чистую культуру идентифицируют на «пестром ряду» сред Гисса
3) Биологические пробы на морских свинках – подкожное введение возбудителя свинкам с предшествующей иммунизацией опытной группы. Заражение куриных эмбрионов и культур клеток
4) Серология – твердофазная ИФА с меченными антитоксинами, тест иммунодиффузии Илека (полоска с антитоксином на среду с культурой C. diphtheriae). Фаготипирование, ПЦР на обнаружение tox-гена; Реакция непрямой гемагглютинации с антигенным эритроцитарным диагностикумом.
Дыхание: факультативные анаэробы
Рост на средах: требовательны к аминокислотам, ионному составу, витаминам, на простых средах не растут (в отличие от др коринебактерий). Диференциально.-диаг. среда Клауберга (телурит-агар с добавлением гемолизированной крови, 24-48 часов, черные или черно-бурые мелкие S-колонии). Элективные среды (8-14 часов, желто-кремовые S-колонии): среда Ру (+10% лошадиной сыворотки) или Ру-Леффлера (кровяная сыворотка с добавлением сахарного бульона). На жидких средах – пленка, помутнение, возможен крошковидный осадок. Т: 36-37°С (мезофилы) pH: 7,4-8,
Благодаря разламывающему механизму деления в мазках клетки C. дифтерии располагаются под углом, напоминая латинские буквы Л, Х, в, Y или «растопыренные» пальцы рук. Такое распол более характ для патогенных дифтерийных палочек, тогда как коринеформные бактерии, явл представителями норм микрофлоры, чаще распол в микропрепаратах в виде «частокола» из нескольких параллельно лежащих клеток.
Культуральные и биохимические свойства. каталазоположителен. C. diphtheriae требовательны к условиям культивирования, растут на пит средах с добавлением гемолизированной крови, лошадиной или бычьей сыворотки, обогащенных аминокислотами, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Для культивирования дифтерийных бактерий испол дифференциально-диагност и элективные кровяные телуритовые среды Клауберга II или среду Тинсдаля (сывороточный агар с телуритом калия и цистином), а также элективную среду Ру (свернутая лошадиная сыворотка) и др среды. По культурально-биохимическим св-вам вид C. diphtheriae не однороден. Выделяют 4 биовара: gravis, mitis, intermedius и belfanti, но 2 последних биовара не идентифицируют. Для дифференциации биоваров испол тест на крахмал. По этому показателю все C. diphtheriae, ферментирующие крахмал, относятся к биовару gravis, а не ферментирующие крахмал - к биовару mitis. Биовар gravis (грубый) на плотных пит средах образует крупные колонии серого цвета в R-форме, напоминающие цветок маргаритку. На жидких пит средах коринебактерии дифтерии биовара gravis растут, образуя пленку на поверхности или крошкообразный осадок. Для биовара mitis (тонкий) характерна S-форма мелких колоний черного цвета, с ровными краями, выпуклой гладкой поверхностью, окруженных зоной гемолиза. На жидких пит средах коринобактерии дифтерии бактерии биовара mitis вызывают равномерное помутнение и мелкозернистый осадок. Возбудитель дифтерии резистентен к высоким концентрациям теллурита калия, ингибирующим рост сопутствующей микрофлоры. Теллурит калия благодаря восстановлению металлического теллура и его соединению с образующимся H,S придает дифтерийным колониям черный цвет. - Для дифференциации с др коринебактериями испол тесты на цистиназу и уреазу. Важнейшим дифференциальным биохимическим признаком C. diphtheriae явл наличие фермента цистиназы, кот выявляют на среде Пизу (сывороточный агар, содержащий цистин и уксуснокислый свинец). «+» цистиназная активность проявляется потемнением среды в виде «облачка» по ходу укола. C. diphtheriae обладают отрицательной уреазной активностью
5. Возбудитель дифтерии: препараты для специфической терапии и профилактики. Возбудитель коклюша. Название по-латыни.
Препараты для профил и лечения дифтерии 1)Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная жидкая (АКДС-вакцина). Содержит взвесь инактивированных возбудителей коклюша, дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин. Адсорбент - гидроксид алюминия.
2)Анатоксин дифтерийно-столбнячный очищенный адсорбированный (АДС-анатоксин). Содержит дифтерийный, и столбнячный анатоксины, адсорбированные на гидроксиде алюминия.
3)Анатоксин дифтерийно-столбнячный очищенный адсорбированный с уменьшенным содерж антигенов жидкий (АДС-М анатоксин). Содержит смесь очищ дифтерий и столбняч анатоксинов, адсорбированных на гидрате оксида алюминия.
4)Анатоксин дифтерийный очищенный адсорбированный с уменьшенным содержанием антигена жидкий (АД-М анатоксин). Представляет собой очищенный дифтерийный анатоксин, сорбированный на алюминия гидроксиде.
5)Сыворотка противодифтерийная лошадиная очищенная концентрированная жидкая. Содержит антитела (антитоксины), способные нейтрализовать действие токсина возбудителя дифтерии. Для получения этого препарата проводят гипериммунизацию лошадей дифтерийным анатоксином, затем их сыворотку очищают от балластных белков и концентрируют.
Возбудители коклюша относятся к :отделу Gracilicutes порядку Burkholderiales
семейству Alcaligenaceae роду Bordetella. вид B. pertussis
6. Возбудитель коклюша: морфология: форма, взаимное расположение, споры, жгутики, капсула, отношение к окраске по Граму.
Морфология: Бордетеллы грам-. Возбудитель коклюша имеет форму короткой овоидной палочки (коккобактерии). Бордетеллы распол чаще поодиночке. Спор не образуют, образуют капсулу. Неподвижные. При окраске наблюдается биполярность (концы окрашиваются более интенсивно вследствие неравномерного распределения липидов в кл). При окраске по Романовскому-Гимзе видна капсула. Облигатные анаэробы. Оптимум температуры 35-37°C. Плохо окрашиваются по Граму, предпочтительно испол толуидиновый синий, выявляющий биполярные метахроматические гранулы (клеточные липоиды).
7. Возбуд коклюша: физиология: требовательность к пит средам, факторы роста, основные пит среды, время образования и характер колоний, ферментативная активность.
Строгий аэроб, оптимальная температура для роста 37оС. Требователен к пит средам, хорошо растет на среде Борде-Жангу (картофельно-глицериновом агаре с добавлением сыворотки крови) или на казеиново-угольном агаре (КУА) с добавлением антибиотиков для подавления сопутствующей микрофлоры; введение угля необходимо для подавления ингибиторов роста. Культивируют при температуре 35-36.
На КУА(казеиново-угольный агар) B. pertussis на 3-4 день образует гладкие выпуклые колонии диаметром около 1 мм, блестящие, серовато-кремового цвета и вязкой консистенции, напоминающие капельки ртути или жемчужины. Колонии паракоклюшных бактерий на КУА образуются на 2-3 день, а колонии B. bronchiseptica выявляются уже на 1-2 день культивирования. На среде Борде-Жангу на 3-4 день коклюшные палочки формируют мелкие (диаметром около 1 мм), гладкие, блестящие, куполообразные колонии, напоминающие капельки ртути и имеющие жемчужный или металлический блеск На кровяном агаре вокруг колоний возбудителей коклюша и паракоклюша образуется не четко выраженная зона гемолиза
Ферментативная активность у палочек коклюша выражена очень слабо: не вызывает изменения цвета пит.среды с тирозином, не расщепляет мочевину, не утилизирует цитрат, оксидаза.
Во внешней среде палочки коклюша неустойчивы. Прямой солнечный свет убивает их через 1-2 часа, УФ-лучи - через несколько минут. При 56оС они погибают через 20-30 минут. Чувствительны к дезинфицирующим веществам и холоду.
Антигены. Антигенная структура бордетелл сложна. имеет 16 агглютиногенов, кот явл поверхност термолабильными капсульными К-антигенами (факторами). Фактор 7 явл общим для всех видов, фактор 1 – специфичен для Bordetella pertussis. Выявлены антигены, общие для всех бордетелл, антигены, специфичные только для Bordetella pertussis и антигены, по кот опред серовары внутри этого вида.
-ТОКСИНЫ: коклюшный токсин (КТ), кот повышает проницаемость сосудов, индуцирует в организме сенсибилизацию к гистамину. На этот токсин вырабатывается специфичный защитный антитоксический иммунитет.
- трахеальный цитотоксин повреждает эпителиоциты
-дерматонекротический термолабильный токсин вызывает воспаление и некроз эпителия дыхат путей, обуславливает спазм периферических кровеносных сосудов.
-термостабильный эндотоксин – ЛПС клет стенки, обладает пирогенным эффектом. Индуцирует выработку цитокинов.
Резервуаром и источником коклюшной инфекции является больной человек.
Коклюш передается с помощью аэрозольного механизма преимущественно воздушно-капельным путем. Обильное выделение возбудителя происходит при кашле и чихании. Поскольку во внешней среде возбудитель не сохраняется длительно, контактный путь передачи не реализуется.
Коклюшная палочка попадает на слиз оболочку верхних дыхательных путей и заселяет реснитчатый эпителий, покрывающий гортань и бронхи. В глубокие ткани бактерии не проникают и по организму не распространяются. Бактериальные токсины провоцируют местную воспалительную реакцию.
После гибели бактерий высвобождается эндотоксин, кот и вызывает характерный для коклюша спазматический кашель. С прогрессированием кашель приобретает центральный генез – формируется очаг возбуждения в дыхательном центре продолговатого мозга. Возбуждение нервного центра может способствовать инициации аналогичных процессов в соседних областях продолговатого мозга, вызывая рефлекторную рвоту, сосудистую дистонию (повышение АД, сосудистый спазм) после кашлевого приступа. У детей могут отмечаться судороги (тонические или клонические).
Возбудитель коклюша - Bordetella pertussis; паракоклюша - Bordetella parapertussis. Материал для диагностики Мокрота, слизь из носоглотки. «Метод кашлевых пластинок» – подносят чашку с пит агаром ко рту кашляющего ребенка, держат в течение 6-8 кашлевых толчков.
Бактериолог метод диагностики 1 день Материал засевают на КУА (кровяно – угольный агар), среду Борде –Жангу (картофельно- глицериновый кровяной агар). В агар добавляют пенициллин для угнетения посторонней флоры. Инкубируют 48-72 часа при 37С. 3-4 день Изучение морфологии выросших колоний. Рост мелких выпуклых влажных блестящих колоний. На КУА – серовато- кремового цвета, на среде Борде-Жангу – жемчужный или ртутный блеск.
Бактериоскопия. В мазках по Грамму видны овоидные грам- палочки. Иммунологическая реакция. С подозрительными колониями ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с коклюшной и паракоклюшной сыворотками.
При «+» результате ставят р-цию агглютинации с сыворотками к ф-рам 1, 7, 14, 12. Учет: Bordetella pertussis: «+» р-ция с антисыворотками к ф-рам 1, 7; Bordetella parapertussis: к факторам 7, 14; Bordetella bronchiseptica: к факторам 7,12.
Изучение биохимических свойств. Определяют уреазную активность.
5 день B. pertussis и В. parapertussis: уреаза # ПЦР – диагностика, ИФА. Материал для исследования – мокрота, слизь из носоглотки, подозрительные колонии с КУА. Обнаруживают ДНК возбудителя. Серологический метод. ИФА, РСК. Рертоспективный диагноз. Агглютинины появляются на 3-4 неделе заб в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вакцинации имеет значение нарастание титра антител в динамике заболевания через 4-5 дней.
Посев на плот пит среды с а/б. Для идентификации возбудителя – р-ция агглютинации на стекле с К-сыворотками. Для ускоренной диагнос. применяют прямую РИФ со специфической флуоресцентной сывороткой и материалом из зева. Серологический метод – обнаружение IgG и IgA против феламентозного гемаггютинина и против токсина В.pertussis.