Нейрогуморальная регуляция функций ворсинок двенадцатиперстной кишки крысы (иммуногистохимическое исследование)
Чумасов Евгений Иванович, д.б.н., профессор, Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины"
Петрова Елена Сергеевна, к.б.н., с.н.с., Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины"
Аннотация
Использование иммуногистохимических маркеров: белка ПГП 9.5, синаптофизина (СФ), тирозинги-дроксилазы (ТГ) и серотонина, позволило выявить в тканях стенки двенадцатипертсной кишки крысы три нервных сплетения: миентеральное, подслизистое, эпителиально-ворсинчатое. Сравнительный ИГХ-анализ (реакции на ПГП 9.5 и ТГ) показал, что ворсинки иннервируются парасимпатическими, но не симпатическими нервными волокнами. В соединительной ткани ворсинок обнаружены гладкие миоциты кровеносных и лимфатических сосудов, плазматические, энтерохромаффинные (ЕС) клетки, а в эпителии, кроме ЕС, также редкие нейроноподобные клетки. Предполагается, что функции ворсинок регулируются как с помощью передачи нервных импульсов, так и гормонально с помощью серотонина.
Ключевые слова: ворсинки двенадцатиперстной кишки крысы, иммуногистохимия, альфа-актин, белок PGP 9.5, тирозингидроксилаза, серотонин нервный селективный ворсинка
Summary
NEUROHUMORAL REGULATION OF RAT DUODENAL VILLI FUNCTIONS (IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY)
Chumasov Eugenii Ivanovich, Doctor of Biological Sciences, professor, St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine. Federal State Budgetary Scientific Institution "Institute of Experimental Medicine".
Petrova Elena Sergeevna, PhD, senior researcher, Federal State Budgetary Scientific Institution "Institute of Experimental Medicine".
St. Petersburg State Academy of Veterinary Medicine,
2 Federal State Budgetary Scientific Institution "Institute of Experimental Medicine",
Using immunohistochemical markers: PGP 9.5, synaptophysin, tyrosine hydroxylase, and serotonin, it was detected in the wall of the rat duodenum, except for two main (myienteral and submucosal) ganglionic plexuses, the third is the mucous epithelial-villous. A large number of terminal PGP 9.5+ parasympatical axons were found inside the connective tissue of the villi. Sympathetic nerve structures in the villi were not detected. It was established that single bipolar neuron-like cells are found in the epithelium. Additional large number of serotonin-synthesizing cells morphologically similar to enterochromaffinocytes were found in the villi. It is assumed that the activity ofvilli is regulated by both nerve stimuli and hormonal by serotonin.
Key words: rat duodenal villi, immunohistochemistry, alpha actin, PGP 9.5 protein, tyrosine hydroxylase, serotonin
Введение
Энтеральную нервную систему (ЭНС), наряду с парасимпатической и симпатической, на основании её характерных признаков, следует относить к метасимпатическому отделу автономной нервной системы [6, 7].
ЭНС представлена двумя известными ган глиозными сплетениями: миентеральным (Ауэрбахово) и подслизистым (Мейснерово), состоящих из огромного количества нервных клеток. У человека в ганглиозных сплетениях насчитываются сотни миллионов нейронов, поэтому ЭНС иногда называют "вторым мозгом" [13] или "первичным мозгом", при сравнении "брюшной нервной цепочки" кольчатых червей (кл. Полихета) [11].
Наиболее изученной в структурном и функциональном отношении является наружная оболочка кишечной стенки. Именно, между её продольным и кольцевым мышечными слоями локализуется миентеральное или межмышечное ганглиозное сплетение (ММНС). Нейроны его регулируют моторику желудка, перистальтику, транспортную функцию, иннервацию сосудов [2, 5-8, 12]. С помощью иммуногистохимических (ИГХ) исследований последних десятилетий в нейронах и нервных волокнах ММНС были обнаружены не только основные медиаторы парасимпатической и симпатической НС (ацетилхолин - АЦХ и норадреналин - НА), но и широкий спектр регуляторных пептидов: холинацетилтрансфераза (ХАТ), тиро-зингидроксилаза (ТГ), серотонин, вещество Р, нейропептид NPY, оксид азота и другие [8, 10]. Недостаточно еще изучены иннервация тканей подслизистой и слизистой оболочек, морфология и функции подслизистого ганглиозного нервного сплетения (ПСНС) двенадцатиперстной кишки, особенности строения и иннервации ворсинок.
Цель настоящего исследования состояла в изучении нервных структур подслизистой и слизистой оболочек двенадцатиперстной кишки крысы с обращением особого внимания на иннервацию ворсинок с использованием селективных нейроиммуногистохимических методов.
Материалы и методы
Работа выполнена на крысах Вистар массой 200-250 г. (n = 12) с соблюдением международных правил Хельсинской декларации о гуманном обращении с животными и "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977г.) и одобрена ЛЭК (протокол №3, 30.11.2017). У крыс выделяли фрагменты двенадцатиперстной кишки (ДНК) и фиксировали в растворе цинк-этанол-формальдегида [3]. Иммуногистохимические реакции на альфа-актин и четыре нейральных маркера: белок ПГП
9.5 [4], синаптофизин (СФ) [1], тирозинги- дроксилазу (ТГ) и серотонин проводили на парафиновых срезах. Для выявления белка ПГП 9.5 использовали поликлональные кроличьи антитела в разведении 1:200 (Spring Bioscience, США), для выявления синаптофизинаполиклональные кроличьи антитела к синаптофизину (MONOSAN, Нидерланды), для катехоламинергических структур симпатической нервной системы - поликлональные кроличьи антитела к ТГ в разведении 1:1000 (Abcam, Великобритания), для серотонина - кроличьи поликлональные антитела к 5-гидроокситриптамину (Leica-Novocastra, Великобритания), для альфа-актина - моноклональные мышиные антитела (клон 1A4, Dako, Дания). Вторичными реагентами служили реактивы из наборов Super Sensitive Polymer-HRP Detection System (Bio Genex, США) и EnVision+System Labbeled Polymer- HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания).
Результаты и обсуждение
Прежде чем перейти к изложению материала об иннервации ворсинок, двенадцатиперстной кишки (ДПК) крыс необходимо дать их краткое гистологическое описание. Ворсинка представляет собой многотканевую систему со сложной организацией. Снаружи каждая ворсинка выстлана столбчатым или цилиндрическим слизистым, каёмчатым эпителием, внутри определяется рыхлая соединительная ткань, в состав которой входят клеточные и тканевые компоненты: фибробласты, гистиоциты, отдельные лейкоциты, плазматические и тучные клетки, а также кровеносные и лимфатические сосуды, тонкие пучки гладкомышечной ткани.
Важно отметить, что с помощью специального иммуногистохимического метода (ИГХ) на альфа-актин нам впервые удалось выявить в ворсинках наличие большого количества гладкомышечных клеток (ГМК) (рис. 1, а). Они имеют сильно вытянутую извитую форму и интенсивно окрашиваются в темно-коричневый цвет. Толщина ГМК составляет в поперечнике, в области палочковидного ядра, 4-5 мкм, а длина - 15-35 мкм. Они встречаются в различных местах ворсинок: одни разрозненно в соединительной ткани, другие располагаются в составе стенок кровеносных сосудов, третьи - в клапанах лимфатических сосудов (рис.1, в, г, д). На продольных срезах через ворсинку иногда можно видеть, что ГМК выстраиваются в виде цепочек вдоль длинной оси и образуют тонкие пучки. При малых разрешениях микроскопа видна непрерывная связь между пучками ГМК ворсинок с мышечной пластинкой подслизистой оболочки (рис.1, а). Гистологический и иммуногистохимический анализ строения ворсинок свидетельствует о том, что они представляют собой органные структуры слизистой кишки со своим автономным кровоснабжением, иннервацией и сходной тканевой организацией.
Как известно, в отличие от ММНС, локализующегося между продольным и кольцевым мышечными слоями кишечника, ПСНС располагается в соединительной ткани подслизистой оболочки и окружено вплотную прилежащими многочисленными пучками коллагеновых волокон и венозными и артериальными сосудами (рис. 2 а, д). ПСНС имеет характерные особенности. Во-первых, ПСНС состоит не из крупных ганглиозных структур, как ММНС, а из микроганглиев с небольшим количеством нервных клеток (от 2 до 8) округлой и грушевидной формы, снабженных длинными отростками, которые характерны для клеток II-типа Догеля. Во-вторых, эти ганглии располагаются относительно разреженно, на определенном расстоянии друг от друга, ветви этого сплетения значительно тоньше ММНС (рис. 2, а). Предполагается, что они участвуют в регуляции местного гомеостаза в подслизистой, а также в поддержании водно-солевого баланса, иннервации кровеносных и лимфатических сосудов слизистой оболочек [5-8, 12]. В настоящей работе с помощью ИГХ реакции на ПГП
9.5 нередко удавалось проследить, что отходящие от нейронов микроганглиев ПСНС отростки образуют тонкие пучки. Часть из них участвует в иннервации дуоденальных желез, а большая часть безмиелиновых аксонов из подслизистой оболочки направляются в слизистую, там разветвляются и в составе артериол и сопровождающей рыхлой соединительной ткани прободают мышечную пластинку и входят в слизистую, где часть из них формирует узкопетлистую ячеистую сеть вокруг желез и между основаниями ворсинок (рис. 2 в, г). Остальные многочисленные аксоны вступают внутрь каждой ворсинки, разветвляются и принимают участие в иннервации их тканей (рис. 2, б). При больших увеличениях хорошо видно, что ПГП 9.5+ и СФ+ терминальные аксоны состоят из четкообразных варикозных расширений и следуют вдоль ворсинок на всем их протяжении вплоть до эпителия. Так как во многих местах терминали находятся в тесной связи с клетками соединительной ткани, с эндотелием обменных капилляров, стенками синусоидных и лимфатических сосудов, с пучками ГМК и с базальной мембраной эпителия, возникает впечатление о непосредственном контакте тех и других. На основании этих признаков можно предположить, что терминальные варикозные аксоны представляют собой дистантные парасимпатические нервные окончания типа en passant.
При использовании ИГХ реакции на ПГП
9.5 в эпителии ворсинок слизистой оболочки ДПК обнаружены необычные нейроноподобные клетки (рис. 2, г) Эти клетки имеют треугольную или веретеновидную форму, небольшие размеры (20-25 мкм), светлые круглые ядра и иммунореактивную к белку ПГП 9.5 и СФ цитоплазму. Тела клеток находятся в тесном контакте с окружающими их энтероцитами и имеют полярность. От одного полюса клетки отходит относительно длинный отросток, который прослеживается вплоть до выхода в просвет кишки. На другом полюсе клетки наблюдается несколько коротких булавовидных выростов, окрашенных в черный цвет, которые тесно прилежат к стенке капилляра, заполненного эритроцитами. По мнению авторов, эти нейроноподобные клетки в эпителии ворсинок представляют собой хемосенсорные элементы внутренней рефлекторной дуги ЭНС.
Для выявления структур симпатического отдела автономной нервной системы были использованы антитела к тирозингидроксилазе, маркеру, селективно выявляющему катехоламины. Установлено, что в мышечных слоях ДПК катехоламинергические волокна встречаются значительно реже холинергических. В мышечной стенке ДПК они проходят в смешанных пучках вместе с парасимпатическими волокнами. Те и другие представлены варикозными аксонами. Чаще ТГ+ симпатические нервные волокна и их терминальные структуры встречаются внутри ганглиозных сплетений, где образуют вокруг холинергических нейронов перицеллюлярные синапсы (рис. 2, е). ТГ+ синаптические аппараты найдены также вокруг мелких артерий и артери- ол в ММНС и ПСНС. Важно отметить, что в ворсинках слизистой оболочки ТГ+ симпатические структуры не обнаруживаются.
Рис. 1. Гладкомышечные клетки в ворсинках двенадцатиперстной кишки крысы. Иммуногистохимическая реакция на альфа-актин. Докраска толуидиновым синим. Ув.: х 100 (а), х 400 (б), х 1000 (в, г)
Рис. 2. Нервные аппараты в двенадцатиперстной кишке крысы.
А - общий вид стенки кишки; б - общий вид ворсинки с СФПТ; в, г - ворсинчатое нервное сплетение; д - ганглии и иннервация сосудов; е - симпатические терминали в микроганглиях. НК - нервные клетки микроганглия. Стрелка - нейроноподобная клетка. ИГХ реакция на белок ПГП 9.5 (в, г), синаптофизин (а, б, д) и тирозингидраксилазу (е). Подкраска толуидиновым синим (в), эозином (а, б), гематоксилином- эозином (д). Ув.: х 400
Рис. 3. Серотонин-содержащие клетки в двенадцатиперстной кишке крысы. ИГХ реакция на серотонин. До- краска толуидиновым синим (а). Ув.: х 100(а), х 400 (б, в.)
Следует остановится еще на одной интересной особенности структурно-функциональной организации ЭНС ДПК. С помощью ИГХ реакции на серотонин в стенке двенадцатиперстной кишки были выявлены мелкие (9-15 мкм) серотонин-содержащие клетки различной формы, снабженные короткими и длинными отростками. Большинство этих клеток локализуется в рыхлой соединительной ткани крипт, часть находится в эпителии ворсинок слизистой оболочки, а часть в самом эпителии (рис. 3, а, б, в). На некоторых срезах прослеживаются признаки миграционной активности ЕС от основания ворсинок до вершины эпителия и сквозь него в просвет кишки.
Присутствие серотонинергических клеток в различных отделах ЖКТ было показано ранее другими авторами [14, 15]. Описанные нами серотонин-содержащие клетки являются энтерохромафинными или (ЕС) клетками.
Вопросы о функции ЕС и роли серотонина как гормона и нейротрансмиттера широко обсуждаются в литературе [10, 14]. Полагают, что трансэпителиальная сигнализация, опосредованная давлением или питательными веществами, индуцирует паракринную секрецию ЕС клетками серотонина. Последний, выступая в роли мессенджер-гормона, индуцирует моторику, секрецию, повышение проницаемости эндотелия сосудов, сенсорное восприятие, миграцию лейкоцитов, дегенерацию тучных клеток в кишечнике. Важное значение выполняет серотонин, выступая в роли нейротрансмиттера, он регулирует механизмы сложной организации рефлекторной деятельности ганглиозных сплетений ЭНС. Серотонин служит химическим передатчиком импульсной активности между интернейронами нисходящих отделов миентерального сплетения [14]. Интересно отметить, что собственно серотонинергические нейроциты и нервные волокна, аналогичные таковым в ЦНС, в ганглиозных нервных сплетений ДПК с помощью использованных ИГХ методов нами не были выявлены. Относительно ворсинок с большой определенностью можно сказать, что их функциональная активность тесно связана и с нервной и гормональной регуляцией.