МтДНК-маркеры позволяют устанавливать видовую принадлежность различных млекопитающих, рыб и прочих живых организмов, однако ввиду наследования митохондриальной ДНК исключительно по материнской линии не подходят для установления принадлежности исследуемого биологического материала чистокровному животному или гибриду. Данная проблема может быть решена с помощью выявления видоспецифичных маркеров ядерной ДНК - микросателлитов (STR-маркеров).
Исследования ядерной ДНК позволили выявить микросателлитные локусы, специфичные для семейств, родов или видов животных. Видоспецифичные STR-локусы (короткие тандемные повторы - short tandem repeats, STR) являются участками ядерной ДНК, состоящими из тандемов повторяющихся нуклеотидов: моно-, ди-, три-, тетра- и т. д., а повторы от 1 до 15 нуклеотидов называют микросателлитами. Анализ STR-локусов (микросателлитов) был рекомендован Международным сообществом судебных генетиков как один из методов видовой идентификации животных при проведении судебно-генетических исследований. Из-за полиморфности микросателлиты приобрели большую распространенность как вид генетических маркеров при изучении филогеографии и структуры популяций некоторых животных. Данный маркер является удобными инструментом для установления принадлежности биологического материала определенному виду животного, половой принадлежности животного (самка - самец), выявления особей гибридного происхождения.
Развитие высокопроизводительных методов анализа генома способствовало созданию и использованию панелей на основе полиморфизмов единичных нуклеотидов при идентификации происхождения животных. Однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism, SNP) - это замена одного основания в последовательности ДНК у представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. Хотя SNP менее разнообразны по сравнению с SYR-маркерами, этот недостаток полностью компенсируется благодаря возможности проводить одновременный анализ нескольких десятков и даже сотен SNP. Преимущество анализа "снипов" состоит в отсутствии особых требований к качеству ДНК, анализу результатов, автоматизации процесса генотипирования и использования микрочиповой технологии. Международным обществом генетики животных (ISAG, International Society for Animal Genetics) разработан перечень маркеров SNP для тестирования одомашненных животных [7]. Выбор SNP для включения в панель осуществляется по результатам тестирования видов и подвидов животных. Как отмечают исследователи, маркеры будут полезны при поиске различий между эволюционно родственными видами и подвидами, как в случае диких животных и их одомашненных сородичей.
Следует обратить внимание, что в рамках молекулярного исследования видового определения животных используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который основан на способности фермента ДНК-полимеразы осуществлять множественное копирование определенного участка ДНК in vitro при условии введения в состав всех необходимых компонентов (праймеров, раствора нуклеотидов, буфера, ДНК-матрицы). Праймеры (короткие нуклеотидные последовательности) являются одним из ключевых компонентов ПЦР и служат так называемой затравкой для синтеза копий цепей исследуемого (целевого) участка ДНК. Как правило, в ПЦР применяются праймеры, входящие в состав коммерческих наборов. Современные технологии позволили исследователям самостоятельно разрабатывать праймеры с использованием онлайн-программ (PrimerBlast, Primer3plus).
Моделирование праймеров, в том числе к специфическим участкам митохондриальной ДНК для установления видовой принадлежности животного, в программах PrimerBlast и Primer3plus происходит с учетом прогнозирования специфичности связывания "затравки" с целевым участком ДНК, расчета оптимальной температуры отжига праймеров и G-C состава. Порядок работы с данными программами можно рассмотреть на примере подбора праймеров для гена COXI бурого медведя. Следует отметить, что Бурый медведь (Ursus arctos) - крупный хищник, обитающий в Евразии, Северной Америки, России (Республика Карелия, Сибирь, материковая территория Дальнего Востока и Камчатки). В начале ХХ в. бурый медведь почти исчез с территории Северной Европы, а в Скандинавии и Финляндии его популяция достигла своего минимума из-за неконтролируемой охоты. Для дизайна и подбора праймеров при работе с онлайн-программами осуществляется следующее:
1) поиск нуклеотидной последовательности гена COXI в базе данных на сайте Национального центра биотехнологической информации в разделе Nucleotide;
2) определение графического изображения исследуемого гена и координаты его расположения относительно других генов митохондриальной ДНК (рис. 3);
Рис. 3. Графическое изображение гена COXI бурого медведя
3) подбор в системе PrimerBlasts возможных вариантов пар праймеров для гена COXI с детальным описанием физических параметров (длины праймеров, GC-составом (в %), температуры плавления) (рис. 4);
4)
Рис. 4. Графическое изображение и сведения о парах праймеров
5) использование файла FASTA для конструирования праймеров в программе Primer3Plus (рис. 5);
6) проверка специфичности праймеров с помощью программы BLAST.
Рис. 5. Интерфейс программы Primer3Plus
После получения достаточного количества амплифицированных фрагментов исследуемого участка ДНК проводится секвенирование по Сэнгеру, которое основано на включении в синтезируемую цепь фрагмента ДНК терминирующих дидезоксинуклеотидов (ddNTP), меченных флуорохромом, и разделение меченых продуктов с помощью высокоразрешающего капиллярного гель-электрофореза на генетическом анализаторе. Полученные данные переводятся в последовательность оснований ДНК с помощью программного обеспечения, записываются в файл-FASTA и анализируются.
Идентификация животных осуществляется в результате сравнения нуклеотидной последовательности фрагмента гена или целевого участка митохондриальной ДНК, полученной в процессе исследования, с различными нуклеотидными последовательностями ДНК, хранящимися в международных базах данных. Последовательность известного биологического вида, полностью совпадающая с анализируемой, свидетельствует об одинаковом биологическом происхождении.
На данный момент существуют три глобальные базы нуклеотидных последовательностей: GenBank, EMBL и DNA Data Bank of Japan. Наиболее развитой и популярной среди исследователей является GenBank - открытая база данных, содержащая все аннотированные последовательности нуклеиновых кислот, а также закодированных в них белков более чем 100 000 различных организмов. Пополнение базы происходит за счет предоставления исследователями своих научных результатов. Для поиска гомологов нуклеиновых кислот в базе GenBank используют программу BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (рис. 6).
Рис. 6. Интерфейс программы BLAST blastn
Программа BLAST может строить карту локального сходства найденных последовательностей и формировать выравнивание в виде изображения (рис. 7). Во вкладке Taxonomy отображаются данные представителей, имеющие нуклеотидную последовательность ДНК, подобную анализируемой.
Рис. 7. Попарное выравнивание нуклеотидной последовательности (на примере Бурого медведя (Ursus arctos))
Вывод о том, что анализируемая ДНК произошла от животного определенного биологического вида (например, бурого медведя) делается при учете проведенного парного выравнивания, построенного в BLAST.
В настоящее время вопросам развития, совершенствования работы в области установления видового происхождения образцов биологического материала животных и использования данных ДНК-типирования в раскрытии и расследовании экологических преступлений уделяется большое внимание. Необходимо отметить положительный опыт работы в этом направлении белорусских ученых. Так, например, на основании проведенных исследований в ГУ "Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь" по установлению происхождения образцов биологического материала животных методом ПЦР-ПДРФ разработаны, запатентованы и включены в Реестр судебно-экспертных методик Республики Беларусь следующие методики:
- Методика дифференцирования биологических образцов от Дикого кабана (Sus scrofa) или от Домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), разработанная на основе SNP-полиморфизма генов MCR1 и NR6A1 с применением соответствующих SNP-маркеров.
- методика исследования полиморфизма микросателитных локусов для видового определения биологических образцов диких животных семейства Оленевые - Благородный олень (Cervus elaphus), Лось (Alces alces), Косуля европейская (Capreolus capreolus), Лань (Dama dama) и дифференциации их от других парнокопытных (бык, овца, коза, свинья; зубр, кабан) с применением двух наборов микросателлитных локусов (STR-локусов): № 1 (Т 108, Т 501, ВМ 1824, CSSM036, RT24, RT9, DYS392), предназначенного для установления видовой принадлежности образцов лося, оленя, косули, лани, зубра / крупного рогатого скота, и № 2 (Т 108, ВМ 1824, RT9, BL4, МсМ 505, SO766), позволяющего установить принадлежность образца овце, козе или дикому кабану / свинье домашней.
Данные методики успешно применяются при расследовании дел о незаконной охоте на территории Республики Беларусь [8].
В качестве положительного опыта применения мтДНК-маркеров для идентификации животного в рамках раскрытия и расследования преступлений можно привести также следующие примеры. В 2003 г. генетики Wan Q. H. и Fang S. G. в рамках расследования убийства тигра в китайском цирке провели молекулярно-генетическое исследование волоса, обнаруженного на месте происшествия, и фрагмента мышечной ткани, изъятого у продавца мяса. В результате анализа участка гена цитохрома b митохондриальной ДНК они установили принадлежность биологического материала тигру [9].
Таким образом, совершенствование работы по внедрению современных молекулярно-генетических методов видового определения животных в экспертную практику позволит укрепить доказательственную базу при расследовании преступлений в сфере экологии, связанных с незаконной добычей и оборотом диких животных, а также преступлений, связанных с фальсификацией продуктов питания (видового состава мясной продукции). В последнем случае результаты ДНК-анализа будут выступать фактором гарантии достоверности информации о продукции, нанесенной на маркировке.
Список библиографических ссылок
1. Кузнецова Н.И. Общественная опасность экологических преступлений: криминологический аспект // Вестник Омской юридической академии. 2018. № 1. С.64-69.
2. Linacre A., Tobe S. S. An overview to the investigative approach to species testing in wildlife forensic science // Investigative Genetics. 2011. Vol. 2.
3. Краева В.Н. Уголовно-правовая охрана видов, занесенных в Красную книгу Российской Федерации // Законодательство и экономика. 2016. № 1. Доступ из справ.-правовой системы "КонсультантПлюс".
4. О состоянии и об охране окружающей среды в Российской Федерации в 2015 г.: гос. доклад. URL: htt://www/mnr.gov.ru/upload/iblock/62f/dokl2015.pdf (дата обращения: 11.01.2021).
5. Комментарий к Уголовному кодексу Российской Федерации / С.А. Боже- нюк, Ю.В. Грачева, Л.Д. Ермакова [и др.]; отв. ред. А.И. Рарог. 10-е изд., пере- раб. и доп. М.: Проспект, 2015. 944 с.
6. Hsieh H.-M., Chiang H.-L., Tsai L.-C. at al. Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals // Forensic Science International. 2001. Vol. 122. P. 7-18.
7. Molecular genetic characterization of animal genetic resources // FAO Animal Production and Health Guidelines. 2011. № 9.
8. Молекулярно-генетическая идентификация биологических следов диких животных при расследовании дел о незаконной охоте в Республике Беларусь / И.С. Цыбовский, С.А. Котова, Т.В. Забавская [и др.] // Теория и практика судебной экспертизы. 2018. Т. 13. № 4. С. 116-123.
9. Wan Q. H., Fang S. G. Application of species-specific polymerase chain reaction in the forensic identification of tiger species // Forensic science international. 2003. Vol. 131. P. 75-78.
References
1. Kuznetsova N. I. Public danger of environmental crimes: the criminological aspect. Vestnik of the Omsk Law Academy. 2018; 1: 64-69.
2. Linacre A., Tobe S. S. An overview to the investigative approach to species testing in wildlife forensic science. Investigative Genetics. 2011; 2.
3. Kraeva V. N. Criminal law protection of species listed in the Red Book of the Russian Federation. Legislation and Economics. 2016; 1. Available from: reference and legal system "ConsultantPlus".
4. On the state and protection of the environment in the Russian Federation in 2015. State Report. Available from: htt://www/mnr.gov.ru/upload/iblock/62f/dokl2015.pdf [Accessed 11th January 2021].
5. Bozheniuk S. A., Gracheva Yu. V., Ermakova L. D., et al.; Rarog A. I., editor. Commentary on the Criminal Code of the Russian Federation. 10th ed., updated and revised. Moscow: Prospekt; 2015: 944 p.
6. Hsieh H.-M., Chiang H.-L., Tsai L.-C., et al. Cytochrome b gene for species identification of the conservation animals. Forensic Science International. 2001; 122: 7-18.
7. Molecular genetic characterization of animal genetic resources. FAO Animal Production and Health Guidelines. 2011; 9.
8. Tsybovsky I. S., Kotova S. A., Zabavskaya T. V., et al. Molecular genetic identification of biological trace evidence of wild animals in the investigation of cases of illegal hunting in the Republic of Belarus. Theory and practice of forensics. 2018; 13: 4: 116-123.
9. Wan Q.H., Fang S. G. Application of species-specific polymerase chain reaction in the forensic identification of tiger species. Forensic science international. 2003; 131: 75-78.
| Маркетинговая деятельность ООО Войс |
| Психология малых групп |