Сравнительный анализ структуры микрофлоры дыхательных путей у ВИЧ-инфицированных пациентов и ВИЧ-отрицательных добровольцев
Золотов Максим Олегович, аспирант кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России
Собина Светлана Сергеевна, студентка VI курса лечебного факультета, ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России
Лямин Артем Викторович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России
Борисова Ольга Вячеславовна, доктор медицинских наук, профессор кафедры детских инфекций, ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России
Чернова Оксана Эдуардовна, кандидат медицинских наук, главный врач государственного бюджетного учреждения здравоохранения "Самарский областной клинический центр профилактики и борьбы со СПИД", Россия
Исматуллин Данир Дамирович, ассистент кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России, Россия
Жестков Александр Викторович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии, ФГБОУ ВО "Самарский государственный медицинский университет" Минздрава России
Аннотация
Выявлены особенности качественного и количественного состава микрофлоры верхних дыхательных путей у ВИЧ-инфицированных по сравнению с ВИЧ-отрицательными добровольцами. Проведено микробиологическое исследование микрофлоры задней стенки глотки у 100 пациентов с ВИЧ-инфекцией и 50 здоровых добровольцев. В группе пациентов с ВИЧ-инфекцией определен уровень CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ лимфоцитов. Идентификацию микроорганизмов проводили с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии.
Выяснено, что у пациентов с ВИЧ-инфекцией наблюдается высокая частота колонизации энтеробактериями - 25 штаммов, выявлено 16 штаммов пневмококка. У 50 обследованных здоровых людей преобладали представители резидентной грамположительной флоры, было выделено 2 штамма пневмококка, 4 микроорганизма порядка Enterobacterales. Установлено, что носительство пневмококка (р = 0,0337), а также колонизация слизистых оболочек верхних дыхательных путей энтеробактериями (р = 0,0152) статистически значимо выше у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Снижение уровня CD19+ лимфоцитов ниже 100 клеток/мкл крови увеличивает риск носительства пневмококка у ВИЧ-инфицированных пациентов (р = 0,037). микрофлора дыхательный инфицированный
Ключевые слова: микрофлора, ВИЧ-инфекция, верхние дыхательные пути, пневмония, пневмококк, энтеробактерии.
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE STRUCTURE OF RESPIRATORY TRACT MICROBIOTA IN HIV-INFECTED PATIENTS AND HIV-NEGATIVE VOLUNTEERS
Zolotov Maksim O., Post-graduate student, Samara State Medical University
Sobina Svetlana S., 6th year student, Samara State Medical University
Lyamin Artem V., Cand. Sci. (Med.), Associate Professor of Department, Samara State Medical University,
Borisova Olga V., Dr. Sci. (Med.), Professor of Department, Samara State Medical University
Chernova Oksana E., Cand. Sci. (Med.), Chief Doctor, Samara Regional Clinical Center for AIDS Prevention and Control
Ismatullin Danir D., Assistant, Samara State Medical University
Zhestkov Aleksandr V, Dr. Sci. (Med.), professor, Head of Department, Samara State Medical University
Features of the qualitative and quantitative composition of upper respiratory tract microflora in HIV-infected compared to HIV-negative volunteers were revealed. Microbiological examination of posterior pharyngeal wall microflora in 100 patients with HIV infection and 50 healthy volunteers was carried out. In the group of patients with HIV infection, the level of CD3 +, CD4 +, CD8 +, CD19 + lymphocytes was determined. Microorganisms were identified using mass spectrometry MALDI-ToF. It was found that in patients with HIV infection there is a high frequency of colonization by enterobacteria - 25 strains, 16 strains of pneumococcus were detected. Representatives of resident gram-positive flora prevailed in 50 healthy people examined, 2 strains of pneumococcus, 4 microorganisms of the order Enterobacterales were isolated. It was found that the wearing of pneumococcus (p = 0,0337), as well as the colonization of the mucous membranes of the upper respiratory tract by enterobacteria (p = 0,0152) is statistically significantly higher in patients with HIV infection. Lowering CD19 + lymphocytes below 100 cells/gl of blood increases the risk of pneumococcus in HIV-infected patients (p = 0,037).
Key words: microflora, HIV-infection, upper respiratory tract, pneumonia, pneumococcus, enterobacteria.
Введение
Верхние дыхательные пути (ВДП) обладают одним из наиболее разнообразных видовых составов микроорганизмов относительно других локусов организма человека. Это обусловлено физиологическим перекрестом микрофлоры желудочно-кишечного тракта и воздухоносных путей в носоглотке. Спектр микроорганизмов данной области включает в себя резидентную (постоянную), добавочную (сопутствующую) и транзиторную (временную) флору обеих систем.
В норме представителями резидентной микрофлоры зева считаются: Neisseria spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Borellia spp., Treponema spp., Actinomyces spp. и др. При этом большую часть микробиоты ВДП составляют представители родов Streptococcus spp. и Neisseria spp. [18]. Именно этой группе микроорганизмов отведена основная роль в реализации отношений между микро- и макроорганизмом.
К добавочной (сопутствующей) микрофлоре зева относятся представители родов Haemophilus spp., Corynebacterium spp. и др. Они составляют примерно 10 % от общего пула микробиоты ВДП [7]. Преобладающая их часть относится к условно-патогенной микрофлоре, представители которой, как правило, находятся в симбиотической связи с макроорганизмом, но при определенных условиях способны вызывать патологические процессы в организме.
Микроорганизмы транзиторной микрофлоры в норме являются временными обитателями организма человека, в котором активно не размножаются. Среди ее представителей в микробиоценозе зева могут присутствовать Escherichia coli, Streptococcus pyogenes и др. [18]. Их длительное обнаружение в тех или иных локусах часто является маркером активного внедрения микроорганизмов или патологического состояния иммунной системы хозяина, сопровождающегося отсутствием адекватного ответа от представителей нормальной микрофлоры.
К основным функциям микрофлоры ВДП относят: обеспечение колонизационной резистентности, инактивацию потенциально патогенных соединений и антигенную стимуляцию иммунной системы организма хозяина [19].
Однако в случае нарушения работы иммунной системы может возникнуть дисбаланс в качественном или количественном составе микрофлоры, а также иммунодефицитные состояния (ИДС). Выделяют первичные и вторичные ИДС. При первичных иммунодефицитах имеют место врожденные (генетические) дефекты в работе одного или нескольких механизмов иммунной защиты [10]. К развитию вторичного ИДС могут приводить: ВИЧ, ионизирующее излучение, прием лекарственных средств с иммуносупрессивными свойствами, сопутствующие соматические заболевания (сахарный диабет) и др.
На сегодняшний день в России эпидемия ВИЧ-инфекции прогрессирует. В Самарской области по состоянию на 2017 г. зарегистрировано 34 377 человек, живущих с ВИЧ [3]. Инфекционные заболевания легких - наиболее часто встречающиеся поражения респираторного тракта у этой группы пациентов. ВИЧ-положительные пациенты переносят пневмонию в 5 раз чаще, чем лица без иммунодефицита [9]. При этом одним из главных механизмов развития поражения легочной ткани является аспирация содержимого ротоглотки, например, во время сна [21].
Таким образом, микрофлора ВДП является важным резервуаром микроорганизмов. Появление в ее составе потенциальных возбудителей инфекций респираторного тракта, особенно у пациентов с ВИЧ, будет способствовать повышенному риску поражения нижних дыхательных путей.
А среди возбудителей бактериальных пневмоний, в том числе у пациентов с вторичными ИДС, основную долю составляют: Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, представители порядка Enterobacterales [15, 16]. Это может свидетельствовать о предшествующих данному заболеванию изменениях качественного и количественного состава микрофлоры ВДП с нарушением барьерной функции нормальной микрофлоры и снижением местного иммунного ответа [12].
По данным отечественных исследователей, среди возбудителей бактериальных инфекций у ВИЧ-инфицированных преобладали грамотрицательные микроорганизмы, удельный вес которых среди всех выделенных патогенов составил 80,8 %. При этом более чем в половине случаев (61,5 %) высева грамотрицательных бактерий обнаружены энтеробактерии. Из представителей этой группы наиболее часто выделялась Klebsiella pneumoniae (38,5 % от общего количества штаммов) [6].
В Санкт-Петербурге было проведено исследование по видовой идентификации микроорганизмов, выделенных от лиц, живущих с ВИЧ, и определение их чувствительности к антибактериальным препаратам. Установлено, что среди штаммов порядка Enterobacterales с множественной лекарственной устойчивостью 40 % приходилось на K. pneumoniae [5].
К одним из основных возбудителей пневмонии у ВИЧ-инфицированных пациентов относится S. pneumoniae. Во многом это обусловлено существованием высокого риска развития пневмококковой пневмонии в группах пациентов без критического снижения уровня CD4-лимфоцитов или даже с их нормальным значением [12].
Основными факторами иммунной системы, которые ответственны за противодействие бактериальным патогенам, являются макрофаги, нейтрофилы, система комплемента и иммуноглобулины. По данным литературы, у ВИЧ-инфицированных больных имеется повышенный уровень IgA, IgG, IgM в сыворотке крови [17, 20], однако выявляется снижение противоинфекционных антител в слюне [17]. При этом иммуноглобулины являются одним из основных факторов борьбы с микроорганизмами, образующими капсулу (S. pneumoniae, энтеробактерии и др.) [11]. Снижение уровня антител способствует нарушению мукозального иммунитета и увеличивает риск колонизации слизистой оболочки ВДП капсульными микроорганизмами.
На данный момент существует несколько способов профилактики возникновения пневмонии у иммунокомпрометированных пациентов. Одним из основных, наряду с коррекцией общего иммунного статуса, является проведение вакцинации [13].
В настоящее время основным возбудителем пневмонии, против которого возможно проведение вакцинации, является S. pneumoniae. Для иммунизации используют полисахаридную (ППВ 23) и конъюгированную (ПКВ 13) пневмококковые вакцины [4]. Полисахаридная вакцина содержит В-зависимые антигены, которые не стимулируют образование длительно живущих клеток иммунологической памяти. Это приводит к необходимости ревакцинации ППВ 23 через 5 лет. Кроме того, она противопоказана детям младше 2 лет. ПКВ 13 приводит к формированию иммунного ответа только против 13 серотипов S. pneumoniae [23]. Таким образом, более выраженный клинический эффект отмечается при сочетанном применении обоих типов вакцин [14].
Еще одним методом профилактики инфекционных поражений легких является прием бактериальных лизатов, нормализующих мукозальный иммунный ответ [13]. При применении этой группы препаратов у пациентов с хроническими рецидивирующими бактериальными заболеваниями дыхательных путей сокращаются частота, выраженность и длительность острых инфекций как верхних, так и нижних дыхательных путей [1].
Таким образом, проблема изучения микрофлоры ВДП у ВИЧ-инфицированных пациентов сохраняет свою актуальность. Дисбиоз слизистых оболочек зева в совокупности с имеющимся нарушением мукозального иммунитета могут способствовать колонизации их условно-патогенными микроорганизмами и повышать риск возникновения пневмонии.
Цель: выявить особенности качественного и количественного состава микрофлоры верхних дыхательных путей у ВИЧ-инфицированных пациентов по сравнению с ВИЧ-отрицательными добровольцами.
Материалы и методы исследования
Было проведено микробиологическое исследование микрофлоры задней стенки глотки у 100 пациентов с ВИЧ-инфекцией и 50 здоровых добровольцев. Все обследуемые не были вакцинированы против пневмококка и не имели признаков острого респираторного заболевания.
Из 50 ВИЧ-отрицательных добровольцев 52 % составили лица мужского пола, 48 % - женского. Медиана возраста пациентов составила 27 лет, 25-й процентиль - 24; 75-й процентиль - 46. У всех обследованных был отрицательный результат иммуноферментного анализа на ВИЧ, выполненный в течение 3 месяцев до момента включения в исследование.
Из 100 ВИЧ-инфицированных больных распределение по полу было в соотношении 50 / 50 %. Медиана возраста пациентов составила 39,7 лет, 25-й процентиль равен 35,4; 75-й процентиль - 46,4. В дополнение к микробиологическому исследованию в этой группе пациентов проводили иммунологическое обследование - определение уровня CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ лимфоцитов периферической крови.
Сбор материала для микробиологического исследования осуществляли в соответствии МУ 4.2.2039-05 "Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории". Используя одноразовые стерильные ватные тампоны, производили забор биоматериала с задней стенки глотки. Полученные образцы в пробирках с транспортной средой Кери-Блэйра в изотермических условиях в течение 24 часов были доставлены в лабораторию, где происходил посев на питательные среды (универсальные хромогенные среды, кровяной агар, шоколадный агар, среда Сабуро). Чашки Петри с посевами инкубировали в термостате при 37° C в течение 24-48 часов. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили с использованием MALDI-ToF масс-спектрометрии на приборе "Microflex LT" ("Brnker", США). Для идентификации S. pneumoniae использовали дополнительные тесты с оптохином и желчью. Всего было выделено 599 штаммов микроорганизмов.