Материал: 1_MIKROBIOLOGIYa_metoda_1_Morfologia

6

1. Рассмотрение строения, химического состава и функций клеточной

стенки бактерий.

Клеточная стенка является структурным компонентом прокариотических клеток, располагается над цитоплазматической мембраной и выполняет ряд важных функций

(Табл. 5.).

В зависимости от особенностей строения клеточной стенки бактерии подразделяют:

при окрашивании по Граму на грамположительные (Гр+) и грамотрицательные (Гр-

);

при окрашивании по Цилю-Нильсену на кислотоустойчивые и некислотоустойчивые.

Таблица 5

2. Изучение техники и механизмов окрашивания микропрепаратов по Граму и Циль-Нильсену.

Окраска сложным методом по Граму

Техника окрашивания по Граму Окраска состоит из четырех этапов:

1)на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, на которую наливают раствор генциан-виолета на 1-2 мин., затем раствор сливают;

2)обрабатывают мазок раствором Люголя 30-60 с. и, не промывая его водой, сливают раствор;

3)обесцвечивают мазок путем нанесения на стекло 95% спирта на 20-50 с, далее промывают препарат водой;

7

4) наливают на мазок фуксин Пфейффера, через 1-2 мин краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионной системой.

Механизм окраски по методу Грама

УГрам+ бактерий проницаемость клеточной стенки невысока, пептидогликан имеет около 40 слоев, толщину до 50 нм и составляет 30-40% сухой массы клеточной стенки. С ним связаны полимеры тейхоевых кислот, которые пронизывают клеточную стенку, «сшивая» отдельные слои в единую структуру. Тейхоевые кислоты способствуют стабилизации ионов магния на поверхности бактерии и тем самым прочному удержанию красителей. При окрашивании по Граму первый краситель – генциан-виолет – в комплексе

сраствором Люголя прочно удерживается в клеточной стенке и не вымывается из нее при обесцвечивании в этиловом спирте, придавая бактерии фиолетовый цвет. Наносимый в дальнейшем краситель (фуксин Пфейффера) уже не воспринимается клеткой. Грам + бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет.

УГрам- бактерий пептидогликан имеет 1-2 слоя, толщину до 15 нм и составляет около 10% сухой массы клеточной стенки. Он покрыт наружной мембраной, в состав которой входит липополисахарид (ЛПС) и другие компоненты. ЛПС является фактором патогенности бактерий – эндотоксином. Наружная мембрана пронизана белками – поринами, что обусловливает высокую проницаемость клеточной стенки. Тейхоевые кислоты отсутствуют. При окрашивании по Граму генциан-виолет легко вымывается из клеточной стенки спиртом, а бактериальная клетка воспринимает второй краситель – фуксин Пфейффера - и окрашивается в красный цвет.

Существуют модификации метода Грама:

-по А.И.Синеву;

-по Г.П.Калине (для выявления менингококков).

При окраске по методу Синева мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, заранее пропитанной раствором генцианового фиолетового и высушенной, на бумагу наносят 2-3 капли воды и выдерживают 1-2 мин.

Примеры Грам+ и Грам- бактерий

Грам+:

1)большинство кокков:

Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк);

Streptococcus pneumoniae (пневмококк);

Sarcina flava (желтая сарцина);

Peptococcus, Peptostreptococcus;

2)спорообразующие палочки:

Bacillus anthracis (возбудитель сибирской язвы);

Bacillus subtilis (сенная палочка);

Bacillus cereus (картофельная палочка);

Сlostridium perfringens (возбудитель газовой гангрены);

Сlostridium tetani (возбудитель столбняка);

Сlostridium botulinum (возбудитель ботулизма);

3)аспорогенные (неспорообразующие) палочки:

Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза);

Mycobacterium leprae (возбудитель лепры);

Corynebacterium diphtheriae (возбудитель дифтерии);

4)актиномицеты.

Грам-:

8

1)кокки:

Neisseria meningitidis (возбудитель менингококковой инфекции);

Neisseria gonorrhoeae (возбудитель гонореи);

род Veilonella (возбудители раневых инфекций);

2)палочки:

Е.coli (кишечная палочка);

Salmonella typhi (возбудитель брюшного тифа);

Shigella dysentheriae (возбудитель дизентерии);

Francisella tularensis (возбудитель туляремии);

Yersinia pestis (возбудитель чумы);

Bordetella pertussis (возбудитель коклюша);

3)микоплазмы:

Mycoplasma pneumoniae (возбудитель пневмонии);

Mycoplasma hominis (условно-патогенный микроорганизм);

4)риккетсии: Rickettsia typhi (возбудитель эндемического сыпного тифа).

Окраска сложным методом по Цилю-Нильсену

Техника окрашивания по Цилю-Нильсену

Окраска состоит из трех этапов:

1)фиксированный мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги и наливают на нее феноловый фуксин Циля (можно пользоваться фильтровальной бумагой, предварительно пропитанной красителем и высушенной). Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят в сторону для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2-3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой;

2)препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 5%-го раствора серной кислоты или 1% соляно-кислого спирта, далее промывают несколько раз водой;

3)окрашивают препарат водно-спиртовым раствором метиленового синего 3-5 мин, промывают водой и высушивают.

Механизм окраски по методу Циль-Нильсена Кислото- и спиртоустойчивость – это способность удерживать краситель при

обработке раствором серной кислоты или соляно-кислого спирта при окраске по ЦильНильсену. Она обусловлена химическим составом клеточной стенки патогенных микобактерий. В их клеточной стенке содержатся в большом количестве липиды, воска, оксикислоты (туберкулостеариновая, фтионовая, миколовая, миколеновая и др.). При окраске по Цилю-Нильсену очень плотную оболочку необходимо «разрыхлить» путем нанесения карболового фуксина Циля с подогреванием. Кислотоустойчивые бактерии прочно удерживают проникший в стенку краситель. При дальнейшем обесцвечивании препарата в кислоте или солянокислом спирте фуксин Циля не вымывается, придавая бактериям красный цвет. Наносимый после этого метиленовый синий уже не воспринимается клетками.

Некислотоустойчивые бактерии при обработке в кислоте теряют фуксин, обесцвечиваются и при докрашивании метиленовым синим приобретают голубой цвет.

Примечание: М. smegmatis устойчива к воздействию кислоты, но не спирта. Поэтому в случае использования солянокислого спирта при окрашивании по Цилю-Нильсена эти микроорганизмы приобретают голубой цвет, а патогенные микобактерии – красный.

9

Примеры кислотоустойчивых бактерий:

Mycobacterium tuberculosis (возбудитель туберкулеза);

Mycobacterium leprae (возбудитель лепры);

Mycobacterium smegmatis (нормальный обитатель слизистой мочеполового тракта).

3. Рассмотрение групп микроорганизмов, не имеющих клеточной стенки.

Утрата бактериями клеточной стенки под воздействием внешней среды (лизоцима, антибиотиков и др.) приводит к образованию:

протопластов;

сферопластов;

L-форм.

Они приобретают сферическую форму, независимо от исходной формы бактерии (палочки или кокки), но различаются по:

происхождению;

осмотической устойчивости;

способности к размножению.

Протопласты Протопласты образуются при полном удалении клеточной стенки у Гр+ бактерий.

Их клеточное содержимое ограничено от внешней среды только ЦМП. Протопласты сохраняют свою целостность и сферическую форму только в изотонической среде; в гипоили гипертоническом растворе - разрушаются. Они сохраняют способность к дыханию, синтезу белков, ферментов, спорообразованию; резистентны к бактериофагам, действию антител, антибиотиков. Они приобретают шаровидную, нитевидную формы, во много раз превышающие размеры исходных клеток. Не способны к размножению.

Сферопласты Сферопласты образуются при деструкции клеточной стенки Гр- бактерий. Сложная

организация клеточной стенки Гр- микроорганизмов приводит к ее частичному разрушению. Сферопласты сохраняют свою целостность и сферическую форму даже в неизотонической среде, так как они устойчивы к разнице осмотического давления между внутриклеточными и внеклеточными отделами. Не способны к размножению.

L-формы

Бактерии (как Грам+, так и Грам-) частично или полностью утратившие клеточную стенку, но сохранившие способность к размножению называются L-формами бактерий (названы в честь института им.Д.Листера, где были впервые выделены).

Подобная трансформация может быть спонтанной (например, у хламидий) или индуцированной (например, под воздействием β-лактамных антибиотиков, иммунных сывороток, ионизирующих излучении, факторов иммунитета – лизоцима, комплемента, некоторых ферментов-аутолизинов и аминокислот.

Выделяют стабильные и нестабильные L-формы: первые не способны к восстановлению синтеза клеточной стенки, а вторые реверсируют в исходные формы после удаления причинного фактора.

L-формы патогенных бактерий способны вызывать хроническую инфекцию, не реагируя на действие ряда антибиотиков, бактериофагов.

10