Материал: 5_Люминесцентный анализ

Оптические методы в биофизике: люминесцентный анализ биологических объектов

Аннотация

Флуоресцентная спектроскопия — эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Целью данной лабораторной работы является изучение способов применения оптических методов в биофизике, а именно люминесцентного анализа биологических объектов. В рамках работы проводилась регистрация спектров флуоресценции пигментов в трех средах: в целом листе, в водном гомогенате и в ацетоновом экстракте (было установлено, что максимум флуоресценции пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту смещается в сторону более коротких волн). Далее проводилась проверка линейности зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации — линейной зависимости на всем графике выявлено не было, но был выявлен участок, на котором она наблюдается (для разведений 1:64, 1:32 и 1:16 в количественных долях). Пигменты, флуоресцирующие в растворе, также, были определены — ими оказались хлорофиллы. Были рассчитаны энергии флуоресцентного состояния для всех образцов (они располагаются в интервале значений от 1,056*10^{-6 до}1,16*10^-6 эВ).

1. Введение

Люминесценция — испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний — делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояний. Один из этих типов — флуоресценция —испускание, происходящее при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически «разрешены», а типичные величины скоростей испускания для них ~10⁸ с ^-.

Флуоресцентные свойства объекта обычно характеризуют спектрами испускания и возбуждения. Спектр испускания флуоресценции — это зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны (в нанометрах) или волнового числа (в см^-1). Спектры испускания зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором он растворен. Спектр возбуждения — это зависимость интенсивности люминесценции при определенной длине волны от длины волны возбуждения. Для большинства флуорофоров квантовые выходы и спектры испускания не зависят от длины волны возбуждающего света. Следовательно, спектр возбуждения флуорофора обычно совпадает с его спектром поглощения. Даже при идеальных условиях для такого совпадения необходимо присутствие единственного флуорофора, а также отсутствие осложняющих факторов, таких, как нелинейность, связанная с большой оптической плотностью образца.

Квантовый выход флуоресценции — это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных.

Флуоресценция молекул имеет следующие характеристики:

1. Стоксов сдвиг

2. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения

3. Правило зеркальной симметрии

4. Времена затухания и квантовый выход флуоресценции.

Для регистрации спектрального состава люминесценции используют приборы, называемые спектрофлуориметрами или люминесцентными спектрометрами (рис.1).

Рисунок 1. Блок-схема спектрофлуориметра

В качестве источника возбуждающего света (1) в приборе чаще всего используется ксеноновая лампа. Прибор снабжен монохроматорами (3,6) для выделения отдельной длины волны как возбуждающего, так и испускаемого света. Оба монохроматора снабжены моторами, что обеспечивает автоматическое сканирование по длинам волн. Кроме того, в устройстве используются линзы (2) и поворотное зеркало (4) для того, чтобы правильно направить поток света в кювету (5). Флуоресценция попадает на фотоумножители (7) и затем количественно измеряется с помощью соответствующих электронных устройств. Выходной сигнал обычно представляется графически на мониторе компьютера или встроенном дисплее (8).

Флуоресцентная спектроскопия — эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужденных состояний. Поскольку только те молекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектроскопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболочке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекулярную динамику. В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 А от флуорофора.

2. Материалы и методы

   1. Регистрация спектров флуоресценции пигментов. Лист растения разделяется на 3 части: 1-ая часть исследуется в целом виде, из 2-ой части готовится водный гомогенат, а из 3-ей – ацетоновый экстракт.

Далее проводится регистрация спектров флуоресценции растительных пигментов в трех образцах:

- целом листе (кусок листа располагается в кювете по диагонали, 60 к направлению возбуждающего луча)

- водном гомогенате (в кювету добавляется 2 мл, раствор не густо окрашен, слегка зеленый)

- ацетоновом экстракте (в кювету добавляется 2 мл).

Условия регистрации спектров: длина волны возбуждения — 430 нм, диапазон сканирования — 600-800 нм, скорость сканирования — 6 нм/с, высокое напряжение на ФЭУ выбирается исходя из уровня сигнала на длине волны 680 нм.

2. Проверка линейности зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации. Спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте измеряются несколько раз (разведенный экстракт в 2, 4, 8, 16, 32 и 64 раза). Для этого из кюветы забирается 1 мл исходного экстракта и добавляется 1 мл ацетона. Перемешайте содержимое кюветы перемешивается и измеряется спектр (условия аналогичные п. 2.1). Повторив данную манипуляцию еще 5 раз, получаем спектры разведений 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 и 1/64.

3. Результаты

   1. Спектры люминесценции растений были зарегистрированы в 3-х средах: целом листе, водном гомогенате, ацетоновом экстракте. Нормирование экспериментальных данных проводилось путем деления значения интенсивности для каждой длины волны на максимально высокое значение из всего ряда данных.

Полученные спектры приведены ниже (график 1).

График 1. Нормированные спектры люминесценции пигментов в 3-срадах.

2. Было произведено 6 последовательных разведений, в ходе чего получено 7 растворов различных концентраций (базовый раствор и разведенные в 2, 4, 8, 16, 32, 64 раза).

График 2. Ненормированные спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте при различных разведениях (от разведения 1:1 до 1:64 в количественных долях).

3. Аналогично п.3.1 были определены максимальные значения интенсивности люминесценции, но уже для ацетонового экстракта и построен график зависимости этой характеристики от концентрации вещества.

График 3. Зависимость максимальной интенсивности люминесценции ацетонового экстракта от концентрации Imax(C) (концентрация выражена в долях от единицы).

Ниже приведена таблица, отражающая максимальные значения интенсивности флуоресценции и длин волн, на которых они были зафиксированы, для всех образцов.

Таблица 1. Параметры измеренных спектров люминесценции.

4. Энергия флуоресцентного состояния (в см^-1) в каждом образце была рассчитана через волновое число — величину, которая часто используется в прикладной физике, в том числе в спектроскопии (рассчитывается как k=2п/длина волны). Количество энергии, которую требуется рассчитать, может быть взято как волновое число в см^-1, не являющееся само по себе единицей энергии. Однако эта величина может быть непосредственно преобразована в единицы энергии из расчета, что 1 см^-1 — это 1,23984*10^-4 эВ. Расчеты приведены ниже.

Таблица 2. Энергии флуоресцентного состояния для экспериментальных образцов.

4. ВЫВОДЫ

   1. В эксперименте мы наблюдали спектры пигментов хлорофиллов — они флуоресцируют в красной области (625-740). Предположительно в эксперименте участвовали следующие разновидности хлорофиллов: хлорофилл а (I_max при длине волны 669 нм — экспериментальное значение совпало с табличным) и, скорее всего, хлорофилл с (I_max при длине волны 684 нм, что всего на 6 нм меньше, чем табличное значение). Небольшое отклонение этой величины от табличного значения может быть связано с присутствием в растворе посторонних примесей, способных немного сдвигать спектр.

   2. Максимум флуоресценции пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту смещается в сторону более коротких волн. Сдвиг спектров может быть объяснен разницей в состоянии электронов – в ацетоне они находятся в более возбужденном состоянии по сравнению с водным раствором, а в водном растворе по сравнению с целым листом. Ацетон является наиболее полярным растворителем из них, поэтому максимум флуоресценции в нем наблюдается при более коротких волнах.

   3. Были рассчитаны энергии флуоресцентного состояния для всех образцов — они располагаются в интервале значений от 1,056*10^{-6 до}1,16*10^-6 эВ.

   4. Максимум флуоресценции пигментов в ацетоновом экстракте при уменьшении концентрации смещается, что можно связать с уменьшением оптической плотности растворов.

   5. Линейность зависимости интенсивности люминесценции пигментов от их концентрации не выполняется. При переходе от наименьших концентраций к более высоким наблюдается сначала увеличение интенсивности люминесценции, а затем ее уменьшение. Изменяются и длины волн от более коротких к более длинным. Таким образом, флуоресценция существенно возрастает, а затем уменьшается из-за реабсорбции испускаемой красной флуоресценции в полосе поглощения хлорофилла. Реабсорбция обусловлена перекрытием коротковолновой области спектра флуоресценции хлорофилла с длинноволновой областью его спектра поглощения. Получается, что пригодным для проведения количественного анализа можно считать диапазон концентраций от 1:64 до 1:16 в количественных долях (что соотносится и с законом Бугера-Ламберта-Бера, который работает преимущественно при низких концентрациях).

Список использованных источников (дополнительных):

1. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://laser-portal.ru/content_893 (дата обращения: 31.10.2020).