Дипломная (вкр): Биологические эффекты воздействия низкоинтенсивного излучения на водные растворы ДНК

Влияния облучения СМП на повреждение ДНК в Thp1 клетках (линии моноцитов). Клеточные культуры в пробирке подвергали воздействию СМП (250 МТ) в течение 1 ч, 2 ч, 3 ч и. Результаты показали, что жизнеспособность облученных клеток была несколько ниже контрольной группы. Анализ ДНК с помощью электрофореза отдельных клеток (кометный анализ) показал, что воздействие СМП не оказывает какого-либо повреждения ДНК облученных в течение 1 и 2 ч., однако наблюдались разрывы одноцепочечной ДНК в клетках после 3 ч облучения Для дальнейшего изучения окислительного повреждения ДНК, клеточную ДНК выделили, гидролизовали и анализировали с помощью ВЭЖХ. Уровень 8 - оксо - 7,8 - дигидро - 2' - дезоксигуанозина осталась неизменным по сравнению с контрольной группой (+ 6,5%,). Результаты показали, что воздействие СМП (250 мТл, при 3 ч) не вызывает окислительный стресс и повреждение ДНК в клетках Thp1 [45].

Hassan Sahebjamei и др [46]. проводили исследование, в котором изучалось действие СМП на ферментативную активность клеток табака в растворе суспензии. В результате активность СОД в суспензиальной культуре клеток табака после действия МП в 10мТ и 30мT была значительно выше, чем в контрольной группе, однако происходит снижение активности каталазы. Причем уменьшение активности больше при индукции в 10мТ, чем при индукции в 30мТ.

.3 Методы исследования водных растворов аминокислот и ДНК

.3.1 ИК - спектроскопия

Метод ИК - спектроскопии дает возможность получить сведения об относительных положениях молекул в течение очень коротких промежутков времени, а также оценить характер связи между ними, что является принципиально важным при изучении структурно - информационных свойств водных систем [47, 48].

Известно, что ядра молекул вдали от фиксированных положений по отношению друг к другу находятся в непрерывном колебательном состоянии. Важная особенность этих колебаний в том, что они могут быть описаны ограниченным числом основных колебаний (нормальные моды). Нормальной модой называется колебание, при котором ядра осциллируют с одинаковой частотой и в одной фазе. Молекулы воды имеют три нормальные моды (рис. 4).

Движения ядер при колебаниях ν1 и ν3 происходят почти вдоль направления связей О - Н, эти моды обычно называют колебаниями растяжения связи (или δОН) или валентными колебаниями связи О - Н. При колебаниях ν2 ядра Н движутся в направлении почти перпендикулярных связям О - Н, мода ν2 называется деформационным колебанием связи Н - О - Н или колебанием изгиба водородной связи. Мода ν3 называется ассиметричным валентным колебанием в отличие от симметричного валентного колебания ν1.Переход молекулы воды из ее основного колебательного состояния в возбужденное описываемое с помощью моды ν2 соответствует инфракрасной полосе 1594,59 см-1 (табл. 2).

Рисунок 4 - Формы колебаний молекул воды и их частоты

Таблица 2 - Сопоставление основных полос поглощения молекулы HO в ИК - спектрах

Гидроксильная группа - ОН способна сильно поглощать спектр в ИК области спектра. Вследствие своей полярности эти группы обычно взаимодействуют друг с другом или с другими полярными группами, образуя внутри- и межмолекулярные водородные связи. Гидроксильные группы, не участвующие в образовании водородных связей обычно дают в спектре узкие полосы, а связанные группы интенсивные широкие полосы поглощения при более низких частотах. Величина сдвига частот определяется прочность водородной связи. Наиболее изучена область основных частот. Для мономерной воды полосы 3725 и 3627 см-1 отнесены к симметричному и антисимметричному колебаниям ОН-группы, а полосы 1600 см-1 - к деформационному колебанию.

Для жидкой воды наблюдаются полосы поглощения и в других областях спектра. В табл. 2 приведены волновые числа и длины волн, а также типы колебаний. При переходе от мономеров воды к димерам и тримерам максимум поглощения валентных колебаний связи О - Н сдвигается в сторону меньших частот. Напротив, для деформационных колебаний Н - О - Н наблюдается смещение в сторону более высоких частот.

Полосы поглощения 3546 и 3691 см-1 были отнесены к валентным модам димеров (Н2О)2. Эти частоты значительно ниже, чем валентные моду ν1 и ν3 изолированных молекул воды (3657 и 3756 см-1 соответственно). Полоса 3250см-1 представляет собой обертоны деформационных колебаний. Между частотами 3250 и 3420 см-1 возможен Ферми-резонанс (этот резонанс представляет собой заем интенсивности одного колебания у другого при их случайном перекрывании).

Важной характеристикой поглощения, является также его интенсивность. Поглощение ИК излучения наблюдается только тогда, когда колебание приводит к изменению распределения заряда внутри молекул, чем больше это изменение, тем сильнее поглощение, т.е. тем выше интенсивность полосы поглощения. Следовательно, чем более полярна группа или связь, тем больше интенсивность соответствующей полосы поглощения, и наоборот - интенсивность неполярной связи равна нулю, т.е. данное колебание в ИК области неактивно и не проявляется. Кроме этого, интенсивность полосы поглощения зависит от других факторов: от концентрации данного вещества; инструментальных причин (ширина щели прибора) и др.

В настоящее время еще не найдено универсальной постоянной для выражения интенсивности ИК поглощения. В качестве определения она обозначается: о.с. - очень сильная, с. - сильная, ср. - средняя, сл. - слабая, о. сл. - очень слабая.

Поглощение ИК-излучения веществом. В двухатомной молекуле АВ атомы А и В удерживаются в определенном положении весьма прочно, однако не совсем жестко. В молекуле могут происходить следующие типы движений 1) поступательное движение молекулы как целого, которое может рассматриваться как движение центра масс; 2) вращение молекулы вокруг центра масс; 3) колебание отдельных атомов, происходящие таким образом, что положение центра масс не изменяется и молекула не вращается; 4) движение электронов в молекуле; 5) вращение электронов и ядер атомов вокруг своих осей (спины электронов и ядер). Таким образом, полная энергия молекулы является суммой поступательной, вращательной, колебательной и электронной энергий. Поступательная энергия мало влияет на молекулярные спектры. Относительные энергии трех различных молекулярных состояний для двухатомной молекулы представлены на Разница между вращательными уровнями составляет сотые доли эВ, между колебательными уровнями - десятые доли эВ и между электронными уровнями - единицы эВ. Колебательные движения в молекуле называются нормальными (собственными или фундаментальными) колебаниями или нормальными модами. Эти колебания совершаются при отсутствии внешнего воздействия за счёт первоначально накопленной энергии (вследствие наличия начального смещения или начальной скорости). Они представляют собой независимые повторяющиеся смещения атомов, при которых положение центра масс не меняется, причем все атомы колеблются в фазе с одной и той же частотой.

Нормальные колебания совершаются с некоторой частотой v, определяемой массами обоих атомов и упругими силами связей. Амплитуда колебаний увеличивается при поглощении молекулой энергии. ИК - излучение, вследствие малой энергоемкости, не затрагивает электроны в молекуле, поэтому с ИК - спектроскопией напрямую связаны случаи вращательного и колебательного движения. Причем чисто колебательных спектров не существует, так как молекулы в основном и возбужденном колебательном состояниях распределены по ряду вращательных состояний, и при переходе молекулы из одного колебательного состояния в другое одновременно происходит изменение их вращательных состояний. Поэтому при рассмотрении колебательных переходов необходимо учитывать вращательные состояния.

Экспериментальные исследования большого числа молекул, обладающих одними и теми же химическими группами, показали, что, независимо от изменений в остальной части молекулы, эти одинаковые группы поглощают в узком интервале частот. Такие частоты получили название характеристических или групповых.

Существование характеристических частот можно объяснить следующим образом. Колебания определенной группы атомов или связей могут быть слабо связаны с колебаниями атомов остальной части молекулы. В этом случае частота колебаний этой группы или связи зависит только от их строения и мало зависит от окружающих атомов и связей. Вследствие этого различные молекулы, содержащие данную группу атомов или связей, будут характеризоваться различными колебательными спектрами, однако в каждом из них будет присутствовать одна или несколько одинаковых или почти одинаковых частот.

Установление характеристических частот позволяет, не производя никаких расчетов, определять по спектру присутствие в молекуле различных групп и связей и тем самым установить строение молекулы.

Спектры с помощью Фурье - спектрометров получают в два этапа. Сначала регистрируется интерферограмма т.е. выходной световой поток в зависимости от разности хода разделенной на когерентные пучки входной волны от источника. Затем путём обратного преобразования Фурье (по разности хода) вычисляется спектр. Вторая часть требует относительно большого объема вычислений, поэтому метод получил широкое распространение только с появлением современных компьютеров. Однако сложность получения спектров с помощью Фурье - спектрометров значительно перекрывается преимуществами над другими спектральными приборами:

1) С помощью Фурье-спектрометров можно регистрировать одновременно весь спектр; 2) Благодаря тому, что в интерферометре входное отверстие больших размеров, чем щель спектральных приборов с диспергирующим элементом такого же разрешения, то Фурье-спектрометры по сравнению с ними имеют выигрыш в светосиле. Это позволяет: а) уменьшить время регистрации спектров; б) уменьшить отношение сигнал - шум; в) повысить разрешение; г) уменьшить габариты прибора; 3) Фурье - спектрометры выигрывают также в точности отсчета длины волны. В дифракционных приборах длину волны можно определить только косвенно, а в Фурье-спектрометрах она определяется непосредственно.

Рассмотрим основные принципы работы ИК - Фурье спектрометров и технику ИК - спектроскопии, с помощью которой исследуются ИК спектры молекул на примере ИК-Фурье спектрометра Tensor 27 Bruker. (рис. 5)

1 - неподвижное зеркало интерферометра, 2 - подвижное зеркало, 3 - светоделительная пластина (светоделитель), 4 - источник излучения, 5 - исследуемый образец, 6 - детектор излучения

Рис. 5. Оптическая схема ИК - фурье спектрометра Tensor 27 Bruker

Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала - неподвижное 1 и подвижное 2 и полупрозрачную светоделительную пластину 3, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника 4, попадая на пластину 3, разделяется на два пучка. Один из них направляется на неподвижное зеркало 1, второй - на подвижное зеркало 2; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце 5 и поступает на детектор излучения 6. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего потока I (х) периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения n и смещения подвижного зеркала х. В результирующей интерферограмме выделяется так называемая точка нулевой разности хода, или точка белого

.3.2 Флюоресценция

Флуоресценция - это одно из явлений, которые могут происходить во время взаимодействия электромагнитного излучения с веществом.

При нормальных условиях подавляющее большинство молекул находится в основном электронном состоянии. Молекулы могут поглощать кванты электромагнитного излучения определённой энергии и переходить в возбуждённое состояние. Это соответствует переходу одного электрона с высшей занятой на самую низкую свободную молекулярную орбиталь. Согласно их мультиплетности, основное и возбуждённое электронные состояния обозначают S0 и S1. Возбуждение большинства флюорофоров S0 → S1 происходит под действием коротковолнового ультрафиолетового (длина волны 300 - 400 нм) или видимого <#"865515.files/image009.gif"> <https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Simple_two_level_diagram.JPG?uselang=ru>

Рисунок 6 - Схематическое изображение флюоресценции.

Тогда доля флуорофоров, возвращающихся в основное состояние с испусканием фотона, и следовательно, квантовый выход:

Ф = Г / Г + knr, (3)

где Г - константа скорости излучательной дезактивации возбужденного состояния,

knr - константа скорости безызлучательной дезактивации возбужденного состояния.

Из формулы следует, что Ф → 1 если Кnr / Г → 0 , то есть если скорость безызлучательного перехода значительно меньше скорости излучательного перехода. Стоит отметить, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь. Энергия кванта света, поглощенного при переходе из основного состояния в возбужденное, и из возбуждённого состояния в основное:

Е погл = Е0 + 1 / 2 ms ω2s q2s (4)

Е изл = Е0 - 1 / 2 ms ω2s q2s (5)

Средняя энергия, выделяемая при переходе называется стоксовыми потерями:

P S = 1 / 2 (Е погл - Е изл) (6)

Природа люминесцентного излучения может быть рассмотрена на простейшей энергетической модели молекулы (рис. 7)

Перераспределение электронов после поглощения света при флюоресценции происходит в очень короткий период времени (10-8 - 10-9с).

Переходы «г» соответствуют процессу колебательной дезактивации молекул и происходят во время столкновения с молекулами других веществ или растворителями. Они не сопровождаются излучением лучистой энергии.

С выделением лучистой энергии происходит только переход «д». При этом энергия переходов:

Ед = Еа < Еб < Ев , (7)

Еδ =h (v0b - v0н) (8)

или другими словами:

Е изл ≤ Е погл (9)

Ν погл > ν изл; (10)

λпогл < λизл.. (11)

Спектр излучения при этом сдвигается в сторону более длинных волн. Это положение формируется правилом Стокса: люминесцентное свечение находится в более длинноволновой части спектра, чем поглощённый свет (рис. 8).

Рисунок 8 - Схематическое изображение закона Стокса - Ломмеля

Закон Стокса - Ломмеля более чётко формулирует это положение спектр флюоресценции, и его максимум всегда сдвинут по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в сторону боле длинных волн.