Статья: Экспериментальная модель сахарного диабета II типа у мышей на основе диеты с избыточным содержанием жиров

Национальный исследовательский Томский государственный университет (НИ ТГУ)

Экспериментальная модель сахарного диабета II типа у мышей на основе диеты с избыточным содержанием жиров

Капилевич Л.В., Захарова А.Н., Дьякова Е.Ю., Кироненко Т.А., Милованова К.Г., Калинникова Ю.Г., Чибалин А.В.

г. Томск

Резюме

Цель исследования: разработать и оценить адекватность модели сахарного диабета II типа у на основе использования диеты с высоким содержанием жиров.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовались самцы мышей C57BL/6. Мы разработали диету для экспериментальной группы, в которой 59% от калорийности приходилось на жиры. Измерение концентрации глюкозы в крови проводилось при помощи портативного глюкометра ПКГ-02.4 Сателлит Плюс (ООО «Компания ЭЛТА», Россия). Образцы крови получались пункцией хвостовой вены. Концентрация инсулина в плазме крови мышей определялась иммуноферментным методом с помощью набора Ultra sensitive mouse insulin ELISA Kit (CrystalChem, США). Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета статистического анализа Statistica 8.0.

Результаты. В ходе исследования показано, что у мышей, питающихся кормом с высоким содержанием жиров, на 3-й нед зафиксирован значительный прирост массы тела. К концу эксперимента масса тела выросла более чем в 2 раза. У мышей, питающихся нормальным кормом, к концу эксперимента масса тела увеличилась на 50%. Отмечено, что применяемая жировая диета также приводила к нарушению толерантности к глюкозе, при этом концентрация инсулина увеличивалась втрое.

Заключение. Полученные результаты демонстрируют, что использование высокожировой диеты у мышей приводит к увеличению массы тела и формированию ожирения, гипергликемии, снижению толерантности к глюкозе и гиперинсулинемии. Все это свидетельствует о высокой степени адекватности разработанной экспериментальной модели заболеванию диабетом II типа. Созданная модель может быть особенно полезна при исследованиях резистентности к инсулину, диабета и ожирения, чтобы обеспечить лучшее понимание патогенеза, а также для проверки эффектов терапевтического вмешательства.

Ключевые слова: сахарный диабет II типа, модель сахарного диабета, жировая диета, инсулиноре- зистентность, гипергликемия.

An experimental model of the obesity and type II diabetes mellitus formation in C57BL/6 mice using a high fat diet was developed and tested. In the study, it was shown that mice feeding high-fat diet had a significant body weight gain during the 3rd week. By the end of the experiment, body weight has more than doubled. In mice that feed chow diet, body weight increased by 50%, by the end of the experiment It was shown that high fat diet also induced glucose tolerance, and the insulin concentration tripled. The data obtained confirm the adequacy of the experimental model of diabetes mellitus type II in mice.

Key words: type 2 diabetes mellitus, model of diabetes mellitus, high fat diet, insulin resistance, hyperglycemia.

Введение

Сахарный диабет (СД) II типа, на который приходится не менее 90% случаев диабета, связан с резистентностью к инсулину в тканях и повышенным уровнем глюкозы в крови [1, 2]. Большинство пациентов с этой формой диабета страдают ожирением, а само ожирение вызывает некоторую степень резистентности к инсулину [3-5].

При СД II типа снижается чувствительность к инсулину в тканях на пострецепторном уровне. Наличие дефекта в передаче сигнала от Р-субъ- единицы к тирозинкиназе приводит к снижению проницаемости клеточных мембран к глюкозе, уменьшается активность белков - транспортеров глюкозы (GLUT), в частности GLUT 2 и GLUT 4. В результате развивается инсулинорезистентность и в ответ на нее - гиперинсулинемия, которая определенное время может компенсировать инсулинорезистентность и поддерживает нормогли- кемию. Избыток инсулина по механизму обратной связи еще больше снижает чувствительность рецепторов к инсулину. Сокращается утилизация глюкозы тканями, увеличивается глюконеогенез в печени, что ведет к гипергликемии. Также при СД II типа снижается чувствительность в-клеток поджелудочной железы к стимуляции глюкозой, что ведет к уменьшению секреции инсулина. В результате запаздывает или отсутствует первая фаза - ранняя фаза секреции инсулина, усиливается глюконеогенез в печени и развивается гипергликемия. СД II типа может быть связан с туловищным ожирением, следствием которого является инсулинорезистентность [6]. Несмотря на значительные достижения, целый ряд молекулярных механизмов регуляции энергетического обмена в норме и патологии остается недостаточно изученным, в то время как необходимы новые подходы к профилактике и лечению диабета [7].

Важным и перспективным направлением поиска новых подходов к лечению данного заболевания являются исследования на экспериментальных моделях. Для моделирования ожирения и сахарного диабета у лабораторных животных используются несколько типов моделей, которые можно разделить на две группы: генетические и негенетические.

Для воспроизведения сахарного диабета II типа на грызунах чаще всего применяют химические цитотоксические диабетогенные вещества - стрептозотоцин, дексаметазон и др., либо сочетанным воздействием химических и диетических факторов [8]. Цитотоксические агенты обладают различными механизмами повреждающего действия на в-клетки поджелудочной железы, поэтому их использование может быть весьма ограничено [9]. Кроме того, в большинстве известных стрептозотоциновых моделей развивается диабет с выраженной инсулинопенией без ожирения, дислипидемии и инсулинорезистентности, что, как правило, не характерно для сахарного диабета II типа [10].

Одной из моделей формирования диабета является содержание животных на высокожировой диете. Питание с высоким содержанием жиров может привести к ожирению, гиперинсулинемии и измененному гомеостазу глюкозы из-за недостаточной компенсации со стороны островков [11]. Поскольку ожирение в этом случае вызвано манипуляциями с питанием, а не с цитотоксическими веществами, считается, что такие модели более сходны с заболеванием у человека.

Цель исследования: разработать и оценить адекватность модели сахарного диабета II типа у мышей на основе использования диеты с высоким содержанием жиров.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовались самцы мышей линии С57БТ/6. Мыши были получены из вивария Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук. Возраст мышей на момент начала эксперимента - 2 нед. Режим содержания животных: день 12 ч, ночь 12 ч, световой день начинается с 6:00, свободный доступ к пище и воде, температура в помещении 24 °С.

Было сформировано две группы: контрольная (мыши, питающиеся обычным кормом, п = 12) и экспериментальная (мыши, находящиеся на жировой диете, п = 12). Контрольная группа питалась кормом для лабораторных животных «Прокорм» (ЗАО «Биопро», г. Новосибирск), в котором на жиры приходилось 18% от общей калорийности. Состав корма: пшеница, ячмень, отруби, глютен кукурузный, мука рыбная, белковая кормосмесь, масло подсолнечное, шрот соевый.

Для экспериментальной группы мы разработали диету, в состав которой входили описанный выше корм «Прокорм» (50%), животный (свиной) (20%) и растительный (подсолнечное масло) (10%) жир, сахар (15%), сухое молоко (5%). Продукты измельчались в блендере в гомогенную смесь, из полученной массы формировались гранулы диаметром до 10 мм и высушивалась в духовом шкафу при 30 °С. Корм готовился впрок на 5 сут и хранился при 4 °С. Диета удовлетворяла следующим критериям: на жиры приходилось 59% калорийности, в том числе 2/3 от указанного количества - на животные жиры и 1/3 - на растительные жиры, жирно-кислотный состав представлен в табл. 1.

Сравнительный состав двух диет представлен в табл. 2.

Эксперимент продолжался в течение 16 нед. Контроль массы тела проводился каждые 2 нед. Тест на толерантность к глюкозе проводился на 1-й и 16-й нед. Измерение концентрации инсулина проводилось на 1-й и 16-й нед сразу после и через 15 мин после внутрибрюшинной инъекции глюкозы.

Таблица 1 Table 1

Таблица 2 Table 2

Макроэлементы

Macronutrients

Тест на толерантность к глюкозе

Измерение концентрации глюкозы в крови проводилось при помощи портативного глюкометра ПКГ-02.4 Сателлит Плюс (ООО «Компания ЭЛТА», Россия). Образцы крови получали при помощи пункции хвостовой вены. диета ожирение гипергликемия глюкоза

Для проведения теста на толерантность к глюкозе мышам не давали корм в течение 4 ч, сохраняя свободный доступ к воде, утром животных взвешивали и определяли концентрацию глюкозы в крови (0 мин). Затем животным внутрибрюшинно вводили раствор 40%-й глюкозы (2 г на 1 кг массы тела) (углеводная нагрузка) [12]. Концентрация глюкозы в крови определялась через 15, 30, 60 и 120 мин после углеводной нагрузки [13]. Оценивались максимальная достигаемая концентрация, время достижения максимума и время возврата к исходному уровню, а также рассчитывался показатель площади под кривой (area under curve, AUC).

Измерение концентрации инсулина в плазме крови

Образцы крови получали при помощи пункции хвостовой вены. Кровь собиралась в капиллярные пробирки Microvette Sarstedt (Германия) 200 мкл с К3ЭДТА.

Центрифугирование образцов проводилось сразу после забора крови в течение 6 мин при 10

об/мин при 4 °С. Плазма хранилась в замороженном виде при температуре -80 °С не более

мес. Концентрация инсулина в плазме крови мышей определялась иммуноферментным методом с помощью набора Ultra sensitive mouse insulin ELISA Kit (CrystalChem, США). Измерение оптической плотности образцов проводилось при помощи ми- кропланшетного спектрофотометра модель Anthos 2010 с фильтрами (400-750 нм). Расчет оптической плотности образцов производился при длине волны 450 нм, референсная длина волны 620 нм.

Для оценки резистентности к инсулину мы рассчитывали индекс инсулинорезистентности HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) - показатель, представленный в работе D.R. Matthews и соавт. (1985), связанной с получением математической гомеостатической модели для оценки резистентности к инсулину [14]. Расчет выполнялся по формуле НОМА-IR = (глюкоза натощак (ммоль/ л) х инсулин натощак (мкЕД/л)) / 22,5.