Статья: Эпидемиологические и микробиологические аспекты назофарингеального носительства Streptococcus pneumoniae

Эпидемиологические и микробиологические аспекты назофарингеального носительства Streptococcus pneumoniae

Лира Табрисовна Баязитова^1,2, Альбина Зуфаровна Зарипова²,

Ольга Феликсовна Тюпкина¹,Татьяна Александровна Чазова¹,

Юрий Александрович Тюрин^1,2, Гузель Шавхатовна Исаева^1,2

Пневмококки являются комменсальными микроорганизмами, обитающими на слизистых оболочках верхних дыхательных путей. Исследователями доказано, что штаммы пневмококков различаются по вирулентному потенциалу. Изложены результаты микробиологического мониторинга за Streptococcus pneumoniae, циркулирующими в носоглотке детей-носителей. Приведены данные определения серотиповой принадлежности и распространенности антибиотикорезистентных вакцинных и невакцинных изолятов. Установлено, что сегодня в Республике Татарстан в составе назофарингеальных пневмококков преобладают вакцинные серотипы, которые характеризуются антибиотикорези- стентностью. Для некоторых невакцинных серотипов был характерен довольно высокий уровень устойчивости к антимикробным препаратам. Серомониторинг циркулирующих в носоглотке детей пневмококков позволяет отслеживать смену (реплейсмент) серотипового состава и оценивать эффективность применения пневмококковых вакцин в регионе.

Ключевые слова: Streptococcus pneumoniae, антибиотикорезистентность, серотипы, носительст- во, пневмококковая инфекция, дети.

EPIDEMIOLOGICAL AND MICROBIOLOGICAL ASPECTS OF NAZOFARINGEAL CARRIER STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

Lira T. Bayazitova^1,2, Al'bina Z. Zaripova²,

Ol'ga F. Tyupkina¹, Tat'yana A. Chazova¹,

Yuriy A. Tyurin^1,2, Guzel' Sh. Isaeva^1,2

Abctract. S. pneumoniae are commensal microorganisms colonizing mucous membranes of upper respiratory tract. Strains of S. pneumoniae could have different virulent potential have proven by researchers. Results of microbiological monitoring of S. pneumoniae strains circulating in nasopharynx of children-carriers are given in this manuscript. Data on determination of serotype and prevalence of antibioticoresistant vaccine/nonvaccine isolates are shown. Established, that nowadays in Republic of Tatarstan drugresistant vaccine isolatesare dominating in nasopharyngeal pneumococci population. Some non-vaccine serotypes characterized by high resistance on antimicrobial drugs. Circulating in nasopharynx strains seromonitoring could show serotype composition replacement and assess the effectiveness of pneumococcal vaccine usage in region.

Keywords: Streptococcus pneumoniae, antibiotic resistance, serotypes, carrier, pneumococcal infections, children

Введение

Пневмококки - комменсальные микроорганизмы, колонизирующие слизистые оболочки верхних дыхательных путей, в то же время Streptococcus pneumoniae являются возбудителями различных форм пневмококковых инфекций (ПИ). Как известно, одними из первых антимикробных антител вырабатываются именно антипневмококковые антитела [1]. Пневмококки попадают аэрозольным путем в носоглотку ребенка. Исследователями доказано, что их штаммы различаются по вирулентному потенциалу, что объясняет патогенез ПИ. Продукция факторов вирулентности может быть обусловлена и действием различных индуцирующих факторов макроорганизма [2, 3, 4]. Макроорганизм обязан защищать себя от вирулентных пневмококковых штаммов, которые неизбежно возникают в процессе генетических (мутационных и трансформационных) изменений, характерных для рода Streptococcus. Развитие инфекционного процесса сдерживают специфические и неспецифические эффекторы иммунитета, о чем свидетельствует наличие антител к поверхностным и внутренним бактериальным антигенным детерминантам. При длительном носительстве пневмококков формируются условия для совместной колонизации с другими серотипами пневмококка и/или другими бактериями, возможной рекомбинации [5]. Благодаря рекомбинации пневмококк адаптируется к выживанию, избегая действия вакцин и антибиотиков, что дает большие преимущества для заселения слизистых оболочек и усиления инвазивного потенциала [5]. Вариабельность вирулентных свойств микроорганизма позволяет существовать практически во всех микроэкосистемах респираторного тракта [6]. Такая убиквитарность возбудителя обусловлена пластичностью генома S. pneumoniae, которая позволяет данному микробу в различной степени синтезировать факторы патогенности в ответ на изменения микробиоценоза, в том числе и респираторного тракта, что способствует селекции высокопатогенных штаммов [5, 6].

Значимыми факторами вирулентности являются белки-адгезины, нейраминидаза, гиалуронидаза и пневмолизин, IgA-протеазы, но наиболее важным - полисахаридная капсула [7, 8, 9].

Колонизация S. pneumoniae формируется в течение первых нескольких месяцев жизни ребенка и зависит от таких факторов, как наличие братьев или сестер, посещение детских дошкольных учр е- ждений, региона проживания [8, 10]. Доказано, что колонизация S. pneumoniae является предпосылкой для возникновения ПИ. Вероятно, характер инфицирования модулирует тип капсулы этого пневмококка, а не генотип [11, 12]. Известно, что в детских дошкольных учреждениях ввиду скопления большого количества детей в течение длительного времени в едином пространстве увеличивается риск колонизации оппортунистическими микробами [13]. Назофарингеальное носительство у организованных детей - это фактор риска распространения этого патогена в сообществе. Необходимо учитывать и тот факт, что к группе риска по ПИ относятся и пациенты старше 60 лет, особенно страдающие хроническими заболеваниями дыхательных путей [2, 13]. По результатам исследований, в тех странах, где введена обязательная вакцинация от ПИ и охват прививками детей достигает необходимого уровня (90 %), наблюдается снижение заболеваемости ПИ не только среди детского, но, что очень важно, и взрослого населения [14, 15].

Угрожающий рост антибиотикорезистентности является глобальной проблемой современности [16]. По мнению исследователей, рациональное применение антибактериальных препаратов вкупе с вакцинацией позволит снизить распространение устойчивых к антибиотикам штаммов [17, 18].

Цель: изучить распространенность пневмококкового носительства у организованных детей в Республике Татарстан, серотиповую принадлежность и антибиотикорезистентность назофарингеал ь- ных изолятов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей-бактерионосителей.

Материалы и методы исследования

Бактериологическое исследование. Биоматериал высевали на плотные питательные среды Columbia agar Base («Conda», Испания) c добавлением 5 % крови. Посевы инкубировали в СО₂-инкубаторе 24 ч. Фенотипическую идентификацию S. pneumoniae проводили на основании морфологических, культуральных данных [19]. Для дифференциальной диагностики использовали оптохиновый тест, лизис в присутствии солей желчи. Для серологической диагностики применяли латекс-агглютинацию «SlidexPneumo-Kit» («BioMerieux», Франция); постановку реакции Нейфельда с пневмококковой антисывороткой «SSI Omniserum», («Statens Serum Institut», Дания).

Молекулярно-генетическое титрование. Серотипование штаммов проводили методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (М-ПЦР) по схеме, представленной в работе R. Pai и соавторов (2006) [19]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 1 х ПЦР-буфер (20 ммоль Трис-HCl pH 8,0; 100 ммоль KCl; 0,1 ммоль ЭДТА; 1 моль дитиотреитол; 0,5 % Твин 20), 200 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (НПО «СибЭнзим», Россия), 2,5 ммоль MgCl₂, 2,0 ед. TaqF ДНК- полимеразы («Promega Corporation», США) и праймеров с концентрациями, как указано в таблице исследования R. Pai [19]. В качестве матрицы использовали образцы выделенной ДНК штаммов (2,5 мкл), протокол амплификации выполняли при условиях: начальный этап - 94° C в течение 4 мин с последующим 30 циклами амплификации 94° C в течение 45 с, 54° C в течение 45 с и 65° С в течение 2 мин 30 с. Продукты амплификации определяли методом электрофореза в 2% агарозных гелях в 1 х TAE-буфере (40 ммоль Трис, 20 ммоль ледяной уксусной кислоты, 1 ммоль EDTA; pH 8,0) при напряжении 120 В в течение 45 мин. Гели окрашивали бромидом этидия (0,5 мкг/мл) и регистрировали изображения. Размеры ампликонов определяли в сравнении с молекулярным стандартом ДНК маркеров (НПО «СибЭнзим», Россия).

Выделение бактериальной ДНК. Выделяли из бактериальной массы чистую культуру с использованием набора «GenElute™ Bacterial Genomic DNA Kits»(«Sigma-Aldrich», США). Средняя концентрация геномной ДНК в М-ПЦР составила 10 нг/мкл. Концентрацию выделенной геномной ДНК определяли спектрофотометрически на спектрофотометре «NanoDrop2000» («Thermo Fisher Scientific», США).

Получение бактериальных лизатов. Штаммы культивировали на Columbia agar Base («Conda», Испания) c добавлением 5 % крови в течение 12 ч при 37° С в атмосфере 5 % СО₂. Бактериальные клетки суспендировали в 250 мкл ТЕ-буфера (10 ммоль Трис-HCl, рН 8,0) и доводили мутность до 1,0 по стандарту Макфарланда. Полученную суспензию немедленно замораживали при -20° С в течение 5 мин.

Тестирование антибиотикорезистентности и интерпретациюрезультатов проводили согласно клиническим рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (версия 2015), EUCAST (2015 г.). Для скрининга пенициллинчувствительности использовали диск с оксациллином 1 мкг («bioMerieux SA», Франция). Профиль антибиотикочувствитель- ностиизолятов изучали диско-диффузионным методом; для оценки чувствительности к Р-лактамным антибиотикам использовали Е-тесты «HiComb MIC Test», («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd», Индия). Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) пенициллина и амоксициллина определяли методом Е-теста. Чувствительными считали изоляты с МПК < 0,6 мкг/мл, нечувствительными к пенициллину - штаммы с МПК > 0,06 мкг/мл.

Статистическая обработка результатов осуществлена с помощью программного пакета GraphPad Prism версия 5.0 («GraphPad Software», США). streptococcus pneumoniae антибиотикорезистентность серотип

Результаты исследования и их обсуждение

Проведено микробиологическое исследование микробиоценоза носоглотки 696 здоровых детей, посещающих детские дошкольные учреждения Республики Татарстан. Период исследования составил 2016-2018 гг. Изучены вирулентные свойства клинических изолятов S. pneumoniae, выделенных от детей-бактерионосителей (n = 207). Распространенность пневмококкового носительства составила 22,7-38,0 % в зависимости от возрастной категории. Удельный вес привитых от ПИ детей-бактерионосителей составил 2,4-49,6 % в зависимости от возраста: 1-3 года- 49,6 %, 3-5 лет - 28,7 %, 5-7 лет - 11,7 %, старше 7 лет - 2,4 %. Были использованы различные типы вакцин: в 85,7 % случаев применялась конъюгированная 13-валентная вакцина «Превенар-13» («Pfizer», Ирландия), остальные дети привиты полисахаридной вакциной «Пневмо- 23», («SANOFI PASTEUR, S.A.», Франция).

Результаты серомониторинга. Доминирующими в 2016-2017 гг. стали серотипы - 19F, 14, 6A/B, 11A, которые входят в состав разрешенных к применению в Российской Федерации пневмококковых вакцин. Наряду с этим в носоглотке детей-бактерионосителей обнаружены и так называемые «невакцинные» серотипы: 35В (4,1 %) и 16F (8,21 %). В 2018 г. серотиповой состав в носоглотке детей-бактерионосителей (n = 166) характеризовался некоторой сменой профиля: наиболее часто встречались «вакцинные» серотипы: 18С - 22 (13,25 %) изолята, 19F - 21 (12,65 %) изолят, 11А и 14 - по 16 (9,63 %) изолятов, 7F - 15 (9 % ) изолятов. Встречаемость серотипов 6А/6В и 23F составила по 7,83 %; 33F обнаружен у 4,81 % носителей. Реже выявляли другие вакцинные серотипы: 31 - 3 (1,8 %) изолята, 12 и 19А - по 1,2 % изолятов, 10А и 35F - по 1 (0,6 %) ребенку. Кроме того, были выявлены серотипы, не входящие в состав пневмококковых вакцин: по результатам молекулярного

серотипирования 8 культур отнесены к серогруппе 35В, 6 изолятов - к 16 F, 2 штамма - к 15А.

Результаты определения чувствительности к антимикробным препаратам (АМП). Анализ динамики чувствительности назофарингеальных пневмококков в зависимости от серотиповой принадлежности показал, что наибольшее количество резистентных к Р-лактамным АМП изолятов принадлежали к вакцинным серотипам: 8 (55,5 %), 7F (50 %), 9V (50 %), 19А (50 %), 6А/В (35,3 %), 19F/B (35,3%) и 19F (31,4%). Резистентность невакцинных штаммов к Р-лакгамным АМП варьировала от 8,3 % (16F) до 33,3 % (15А); все изоляты серотипа 31 были чувствительны к Р-лактамам.

Таблица Встречаемость устойчивых к АМП штаммов пневмококков в зависимости от серотиповой принадлежности