ку от источника азота могут зависеть не только ростовые, но и продуктивные показатели. Более того, заслуживает внимания такое направление, как возможности регуляции темпов развития, стимуляции или пассивации метаболических процессов модификацией видов источников азота, дробности их внесения в субстрат и т.п. При направленном биосинтезе, например, целлюлолитических ферментов грибом Peniophora gigantea наивысшая биохимическая активность клеток наблюдается на средах с органическим азотом (аспарагин, пептон и др.) (Мосин, 2002).
Питательные резервы мицелия имеют большое значение для последующего плодоношения (Robert, 1977, 1979; Morimoto et al., 1981). При использовании традиционных методов культивирования вегетативная и репродуктивная фазы развития грибов проходят на едином субстрате. В методах японских авторов (Oyama et al., 1974) вегетативная и репродуктивная фазы обеспечиваются оптимальными условиями питания на разных средах. Причем после появления зачатков плодовых тел все используемые соединения азота поступают из мицелия. Плодовые тела таких видов, как Flammulina velutipes, Panus tigrius, Pleurotus ostreatus и других, легко плодоносящих в культуре, образуются на том же субстрате, на котором сохраняется в лаборатории культура гриба.
В качестве питательных субстратов для получения плодовых тел в лабораторных исследованиях используют пористые материалы, например, смоченные разбавленным пивным суслом или минеральной средой древесные опилки и древесную муку, мелко нарезанные веточки и хвою, высушенный ржаной хлеб с водой, кашицу из хлебных крошек, размягченную в 40 %-ном растворе лимонной кислоты. Многие исследователи занимались разработкой питательных сред для получения плодоношений отдельных видов высших базидиомицетов: Flammulina velutipes Lentinus edodes, Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus
и др. (Plunkett, 1953; Leatham, 1983). Однако трудно судить,
оптимальны ли предложенные среды, так как отсутствуют качественные и количественные данные о продуктивности плодоношения грибов на этих средах.
35
Плодоношение можно получить как на твердых, так и на жидких средах в поверхностной культуре, но на жидкой среде плодовые тела обычно появляются позднее (Бухало, 1988).
Состав питательной среды является одним из определяющих факторов, влияющих на плодоношение высших базидиомицетов в условиях чистой культуры (Бухало, 1988). Изучение влияния компонентов питательной среды на плодоношение, проведенное на синтетических средах рядом исследователей, позволило сделать определенные выводы, суммированные Ф. Орриер (Horriere, 1979). Для получения плодоношения в чистой культуре питательные среды должны соответствовать определенным требованиям. Источник углерода в наиболее часто используемых для плодоношения средах вносится в виде углеводов (глюкозы, мальтозы, сахарозы, спирта). У некоторых видов, особенно древоразрушающих грибов, добавление в питательную среду фильтровальной бумаги или соломы стимулирует плодоношение. Азот в такие среды вносится в органической (в виде аланина, аспарагина, других аминокислот) или минеральной форме. В последнем случае предпочтение отдается аммонийным солям.
Большое значение для развития организмов и образования ими метаболитов имеет количественное соотношение источников углерода и азота, содержащихся в среде. Известно, что для наиболее благоприятного роста мицелия в среде должно существовать определенное соотношение между углеродом и азотом, что составляет примерно 20:1 (С:N = 20) (Беккер, 1988). Однако такое соотношение углерода и азота не всегда благоприятно для образования метаболитов. Например, далеко не во всех случаях биосинтез антибиотика происходит пропорционально накоплению биомассы микроба-продуцента (Мосин, 2002). Зачастую при хорошем росте организма не наблюдается образования антибиотика или он синтезируется в небольшом количестве. Поэтому при культивировании штамма с целью образования им веществметаболитов необходимо в каждом конкретном случае подбирать соответствующие соотношения углерода и азота в среде. В питательной среде, предназначенной для получения стадии телеоморфы у базидиальных грибов также большое значение имеет отношение С:N. При его очень высоких показателях плодоношение обычно отсутствует, а при очень низких - образуется много
36
зачатков, но плодовые тела не развиваются (Plunkett, 1953; Sugimori et al., 1971; Horriere, 1979; Бухало, 1988). Оптимальное значение отношения С:N в этом случае приближается к 30, оно зависит от состава среды (Horriere, 1979), некоторое увеличение в которой азота и уменьшение углерода ускоряют появление плодоношения.
По сведениям З.Э. Беккер, приблизительно 17 – 18 минеральных элементов необходимы для основного обмена грибов.
Вих число входят макро- и микроэлементы, такие как сера, фосфор, калий, железо, медь, цинк, марганец, молибден, кальций.
Вэтих же работах указывается возможность потребности в кобальте, галлии, боре, скандии, ванадии (Беккер, 1963; Беккер,
1988).
Достоверно выявлено, что изменение компонентов питательной среды сказывается на накоплении минеральных веществ в мицелии. Так, количество золы в мицелии трутовика Fomes marginatus оказалось очень большим при выращивании его на неразбавленной среде Варена (Рипачек, 1967). Количество минеральной золы, встречающееся у грибов, колеблется в пределах от 6 до 12 % от массы сухого мицелия. В их зольном составе обычно преобладают фосфор и калий, меньше магния и железа. Так как потребность в минеральных компонентах питательной cреды складывается на основе преобладающих у данного вида путей метаболизма, состав основных компонентов золы может варьировать. Так, у дрожжей с преобладанием гликолитического пути обмена, связанного с переработкой углеводов через путь спиртового брожения, при слабом размножении клеток в составе золы обнаружено до 50% фосфора, который особенно необходим для этих процессов, и 25% калия. Однако у малоспособных к спиртовому брожению, но сильно разрастающихся гифообразных грибов наблюдается в золе обратное соотношение (Беккер, 1988). В остальных 25% от состава золы грибов в обоих случаях можно обнаружить до 50 различных элементов, обычно встречающихся в почве: марганец, железо, магний, цинк, медь, кальций (Добровольский, 2004). Фосфор, калий и сера составляют контингент самых важных неорганических компонентов обмена.
Данные о роли многих микроэлементов в процессах роста и метаболизма культур микроорганизмов представлены, в боль-
37
шинстве своем, общими сведениями. Обзор роли железа, магния, кальция, калия, а также целого ряда прочих микроэлементов свидетельствует, что исследования в этой области, касались, в основном, продуцентов антибиотиков. Микроэлементы Cu, Zn, Mn, Мо, Со также играют существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов, причем роль этих элементов в клеточном метаболизме ксилотрофных базидиомицетов велика и в достаточной степени изучена.
Названные элементы обладают высокой каталитической активностью в процессах внутриклеточного обмена. Их каталитическая активность возрастает в тысячи и миллионы раз в тех случаях, когда ионы металлов соединятся с молекулами органических веществ и образуют так называемые органоминеральные комплексы. Эти внутрикомплексные металлорганические соединения (хелаты) играют важную роль в реакциях фермент – субстрат.
Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем. Представителями этой группы ферментов являются полифенолоксидазы и аскарбиноксидазы, нитратредуктаза, альдегидоксидаза и др. Особую значимость медь имеет для ксилотрофных безидиомицетов – грибов белой гнили, поскольку ионы меди входят в состав активных центров «голубых» оксидаз. В активный центр лакказ входят четыре иона меди, координированное взаимодействие которых приводит к сопряжению процесса одноэлектронного окисления субстратов – доноров с четырехэлектронной реакцией восстановления дикислорода (Горбачева и др., 2008). Установлено, что глубинная биомасса высших базидиальных грибов обладает значительным потенциалом для связывания ионов меди (Ровбель и др., 2004). Изучено влияние различных концентраций меди на накопление биомассы и синтез липидов у Pleurotus ostreatus. Добавление в среду ионов меди в низких концентрациях (1 мМ) способствовало, на фоне некоторого угнетения роста, интенсивному накоплению общих липидов, тогда как повышенное содержание элемента (5 мМ) приводило к резкому снижению обоих показателей (Николайчук и др., 2005). Различное действие низкой и высокой концентраций ионов меди на накопление общих липидов в мицелии может
38
быть обусловлено разной степенью ингибирования (или активирования) ионами меди ферментов, участвующих в синтезе липидов, а также изменением структуры мембран клеток (Демидчик и др., 2001).
Марганец входит в состав многих ферментных систем ксилотрофных базидиомицетов и, в первую очередь, в состав карбоксилаз. Он принимает, по-видимому, участие в синтезе протеиназ. Марганец входит также в состав фосфорилаз, которые участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Фермент Mn-зависимая пероксидаза был выделен наряду с лигниназой из культуральной жидкости гриба
Phanerochaete chrisosporium (Kuwahara et al., 1984). Установле-
но, что фермент содержит гем и окисляет фенольные соединения в присутствии перекиси водорода. Однако из пероксидаз этот фермент отличается тем, что для проявления его активности необходимо присутствие в среде марганца (Harvey et al., 2001). Данный фермент способен регенерировать пероксид водорода, используя в качестве доноров протонов восстановленные глутатион и NADH (Asada et al., 1995). Обнаружено позитивное влияние ионов марганца на темпы формирования такой маркерной морфологической структуры как коричневая пленка
уLentinus edodes (Цивилева и др., 2006).
Вцелом, обзор данных о роли микроэлементов в процессах роста и метаболизма базидиомицетов, свидетельствует о том, что конкретная информация однобока и несколько ограничена. Ука-
зывается, что недостатком в среде минеральных элементов, в частности фосфатных и сульфатных ионов, К, Mg, ряда других микроэлементов (железа, цинка, марганца, меди, бора и молибдена) часто ингибируется плодоношение макромицетов в культуре. (Бухало, 1988). Определенный интерес, на наш взгляд, представляет исследование роли, в частности, в развитии культур древоразрушающих базидиомицетов, ряда эссенциальных элементов, таких как селен, германий. Факт повышенного содержания селена в плодовых телах базидиомицетов установлен и описан в литературе (Ермаков, Ковальский, 1979; Блинохватов, 1995). Наши исследования, проведенные в 19962002 гг. обнаружили интересные зависимости в реакциях на внесение соединений селена в питательные среды у быстро-
39