МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
УО «ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Факультет биотехнологический
Кафедра биотехнологии
РЕФЕРАТ
по дисциплине: Системная биология (Иммобилизованные клетки и ферменты)
на тему: Иммобилизация растительных клеток и клеток животных
Денисюк Виктор Анатольевич
ПИНСК 2021
Введение
Изолированные растительные клетки, как и клетки микроорганизмов, можно культивировать invitro в колбах на качалках или в ферментерах, а возможность использования культур растительных клеток для получения биопрепаратов уже давно общепризнана. Из примерно 30 000 известных природных соединений более 90% можно обнаружить в высших растениях. Культивируемые растительные клетки тотипотентны, т. е. в принципе в них может экспрессироваться вся генетическая информация, и, следовательно, любое вещество, находящееся в интактном растении, можно получить, культивируя клетки данного растения. В настоящее время многие из промышленно важных соединений, используемых в фармацевтической, пищевой и парфюмерной промышленности, выделяют из тканей возделываемых или дикорастущих растений. Эти вещества имеют сложное химическое строение, и поэтому их трудно получить каким-либо другим способом. Возможности получения некоторых важных видов растительного сырья ограничены уже сегодня или могут стать ограниченными в ближайшем будущем. В связи с этим настоятельно необходимы поиски и разработка альтернативных источников. Одним из таких источников являются культуры растительных клеток; за последнее десятилетие в этой области достигнуты значительные успехи. Так, недавно в Японии был впервые внедрен промышленный способ получения природного соединения (шиконина), основанный на культивировании растительных клеток [1].Однако для промышленного использования культур растительных клеток с целью получения широкого спектра органических соединений необходимо решить ряд основных проблем. Растительные клетки в культуре значительно отличаются от клеток микро организмов, поэтому новейшие способы ферментации, разработанные для последних, в большинстве случаев не годятся для культивирования растительных клеток. Изучался биосинтез различных соединений в модельных системах, подобранных таким образом, чтобы они включали различные виды биосинтеза: синтез denovo из простых источников углерода (например, сахарозы), синтез из добавленных к питательной среде предшественников или биоконверсия (например, гидроксилирование). Для сохранения биосинтетической активности большое значение имеет жизнеспособность клеточных препаратов, поэтому применялись различные методы иммобилизации и изучалась жизнеспособность и биосинтетическая активность полученных препаратов [3].
1. Методы иммобилизации растительных клеток
Растительные клетки достаточно чувствительны к изменениям окружающей среды, и, следовательно, для иммобилизации могут быть использованы только наиболее мягкие методы.
Установлено, что для крупных чувствительных растительных клеток самым подходящим из широко используемых методов иммобилизации является включение в гель. Известны также примеры иммобилизации растительных клеток методами адсорбции и ковалентной сшивки. Иммобилизацию растительных клеток проводят в стерильных условиях, поскольку растительные клетки растут относительно медленно и, следовательно, очень чувствительны к заражению быстро растущими клетками микроорганизмов. В связи с этим используемый для иммобилизации носитель должен выдерживать соответствующую обработку, например автоклавирование [2].
1.1 Включение в гель
Для иммобилизации растительных клеток путем включения в гель можно использовать несколько различных методик. Конечная концентрация иммобилизованных клеток в препарате может варьировать в широких пределах (от нескольких процентов до 50% (по весу) и выше). Оптимальную концентрацию клеток нужно определять отдельно для каждого конкретного случая. Для иммобилизации клеток различных типов, в том числе растительных, широко используют альгинат кальция. Условия включения в гель альгината кальция очень мягкие, полимер можно стерилизовать автоклавированием, и кроме того, процесс иммобилизации обратим, что достигается добавлением агента, связывающего кальций (например, ЭДТА или лимонной кислоты). Конечная концентрация альгината в препарате иммобилизованных клеток может быть разной в зависимости от типа используемого альгината. Стабильность геля возрастает с увеличением концентрации полимера, но при высоких концентрациях альгината суспензия альгинат/клетки становится очень вязкой, что может затруднить процесс образования гранул.
Х-Каррагинан представляет собой полисахарид, содержащий сульфоэфирные группы (сульфированы более 20% остатков сахара) и не растворимый в холодной воде. Однако при нагревании он растворяется, а при последующем охлаждении образует гель. Температура образования и качество геля зависят как от концентрации полимера, так и от количества и типа присутствующих в растворе катионов (например, K+, NH4+, Ca2+ или Ba2+).
Агар и агароза (очищенный препарат агара) образуют гели при охлаждении горячего раствора. Для понижения температуры гелеобразованпяагарозу можно химически модифицировать введением гидроксиэтильных групп. Оптимальная температура геле-образования при иммобилизации растительных клеток 25-30 °С. Преимуществом геля агарозы является то, что он стабилен в отсутствие противоионов. В последнее время для иммобилизации клеток микроорганизмов широко применяют полиакриламид. Однако некоторые вещества, используемые при радикальной полимеризации акриламида, токсичны для растительных клеток. Были разработаны методы, позволяющие уменьшить токсичность акриламида и других реагентов, что позволило получить жизнеспособные растительные клетки, иммобилизованные в полиакриламидном геле.
Для иммобилизации биокатализаторов можно использовать предполимеры уретана с концевыми функциональными изоцианатными группами. При смешивании таких предполимеров с каким-либо водным раствором, например клеточной суспензией, гель образуется в течение нескольких минут. В присутствии воды предполимеры уретана реагируют друг с другом с образованием карбаматных связей. Иммобилизованные данным способом клетки Lavandulavera использовали для получения пигмента.
Для иммобилизации растительных клеток можно использовать мембраны различной конфигурации. Впервые иммобилизация растительных клеток данным методом была продемонстрирована на полых трубчатых реакторах. Растительные клетки наносят на наружную поверхность полой трубки и через нее с относительно высокой скоростью прокачивают обогащенную кислородом питательную среду. При изучении модельной системы было показано, что в полом трубчатом реакторе иммобилизованные клетки Glycinemax продуцируют фенольные соединения с постоянной скоростью в течение 700 ч [4].
1.2 Адсорбция
Иммобилизация с помощью адсорбции на твердых носителях является очень мягким методом. Однако до настоящего времени его не использовали для иммобилизации растительных клеток.Растительные протопласты, адсорбированные на поперечно-сшитом декстране, сохраняли свою жизнеспособность [2].
1.3 Ковалентное связывание
Метод ковалентного связывания клеток микроорганизмов с твердым носителем применяют достаточно редко. Что же касается его использования в случае растительных клеток, то известен только один пример ковалентной сшивки клеток Solanumaviculare с нерастворимой матрицей из полифениленоксида. Носитель активировали глутаровым альдегидом, и после удаления избытка глутарового альдегида гель добавляли к суспензии растительных клеток. Иммобилизованные клетки использовали в колоночном реакторе для получения стероидных гликозидов в течение 11 суток [4].
2. Жизнеспособность иммобилизированных растительных клеток
В большинстве случаев необходимо, чтобы растительные клетки после иммобилизации сохраняли жизнеспособность. Это особенно важно, когда в процесс синтеза denovo вовлечены все пути метаболизма клетки [5].
2.1 Окрашивание
Окрашивание флуоресцеиндиацетатом (ФДА) часто используют для определения жизнеспособности клеток. После адсорбции ФДА клетками при наличии эстеразной активности он деацетилируется и становится флуоресцирующим. Окрашенные клетки рассматривают с помощью микроскопа, снабженного УФ-источником света.
Выраженное в процентах отношение клеток, находящихся в данный момент времени на какой-либо стадии митоза, к их общему числу в популяции называют митотическим индексом (МИ). По его изменению в течение инкубации можно судить о жизнеспособности клеток. Удобным красителем для окраски хромосом после фиксации является карбол-фуксин [5].
2.2 Дыхание
О жизнеспособности клеток судят по их дыханию, которое можно измерять в течение инкубации через различные промежутки времени. Измерения проводят с помощью кислородного электрода Кларка по следующей стандартной методике. Клетки, суспендированные в среде (сырой вес 100-200 мг), или соответствующее количество иммобилизованных клеток (общий объем 5 мл) инкубируют при 25 °С. G помощью самописца регистрируют потребление кислорода, определяют сухой вес клеток (см. ниже) и рассчитывают удельную скорость дыхания.
Очень часто дыхание иммобилизованных клеток менее интенсивно, чем дыхание такого же количества суспендированных в среде клеток, что объясняется диффузионными затруднениями внутри полимерной сетки [5].
3. Способность иммобилизированных растительных клеток к биосинтезу
В клетках высших растений протекает множество химических реакций, которые можно использовать для синтеза сложных органических соединений. Наряду с реакциями биоконверсии, такими как гидроксилирование, метилирование и т. д., в растительных клетках осуществляется синтез органических соединений denovo из более простых соединений углерода. Иммобилизованные растительные клетки, сохранившие жизнеспособность, по-видимому, обладают такой же биосинтетической активностью, как и суспендированные в среде. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие способность иммобилизованных растительных клеток к биосинтезу [7].
3.1 Биоконверсия
12-в-Гидроксилирование производного дигитоксина с образованием производного дигоксина представляет промышленный интерес. Эту реакцию способны осуществлять как суспендированные в среде, так и иммобилизованные клетки Digitalislanata в периодическом или непрерывном режимах. Клетки Digitalis, иммобилизованные в альгинатном геле могут быть использованы для гидроксилированияметилдигитоксина в метилдигоксин в периодическом режиме в течение 180 суток (если каждые трое суток гранулы геля с иммобилизованными клетками переносить в свежую среду). В данном случае время использования иммобилизованных клеток значительно превышает соответствующее время для клеток, суспендированных в среде; следовательно, с помощью иммобилизованных клеток удается получить более высокий выход продукта на единицу биомассы.
Культивируемые клетки Catharanthusroseus разных линий синтезируют различные индолсодержащие алкалоиды, такие как аймалицин, серпентин и катарантин. Конечным ферментом биосинтеза аймалицина является катенаминредуктаза. Для превращения катенамина в изомеры аймалицина использовали клетки С. roseus, включенные в агарозный гель и обработанные специальным веществом, повышающим проницаемость клеточных мембран [6].
3.2 Синтез из предшественников
Если для какого-либо соединения известен путь биосинтеза и доступны вещества-предшественники, то его выход можно существенно увеличить, добавляя эти предшественники в питательную среду. Путь биосинтеза изомеров аймалицина в клетках С. roseus детально изучен, и отдаленными предшественниками этих изомеров являются триптамин и секологанин [6].
3.3 Синтез denovo
При синтезе denovo сложных органических веществ из простых органических соединений с помощью культивируемых растительных клеток используется большая часть путей клеточного метаболизма. Поэтому синтез denovo осуществим только в том случае, если клетки жизнеспособны. В настоящее время известны лишь несколько примеров синтеза denovo сложных органических соединений с помощью иммобилизованных растительных клеток. Очевидно, сама по себе иммобилизация практически не влияет на биосинтетическую активность клеток. Ниже описаны два примера синтеза denovo: индолсодержащих алкалоидов и антрахинонов.
Индолсодержащие алкалоиды, такие как аймалицпн и серпентин, удалось получить с помощью клеток С. roseus, включенных в альгинатный и полиакриламидный гели. Для получения этих алкалоидов были отобраны специальные линии клеток.
Антрахиноны синтезируются различными культурами растительных клеток. Быдо описано получение антрахинонов с помощью включенных в альгинатный гель клеток Morindacitrifolia. Было установлено, что в одинаковых условиях иммобилизованные клетки М. citrifolia синтезируют в 10 раз больше продукта, чем клетки, суспендированные в среде [7].
4. Иммобилизованные клетки животных
Ограниченность использования иммобилизованных животных клеток в значительной мере была обусловлена трудностью их культивирования. За последние годы достигнуты большие успехи в разработке методов контролируемого культивирования in vitro млекопитающих. Можно выделить несколько факторов, которые способствовали быстрому развитию этой области биотехнологии, а именно:
- получение непрерывных, полностью охарактеризованных клеточных линий;
- обнаружение специфических факторов роста;