- разработка аппаратуры для культивирования изолированных клеток в оптимальных условиях.
Быстрое развитие методологии культивирования клеток оказало огромное влияние на научные исследования во многих областях биологии. Постоянно упрощаются и совершенствуются в частности, методики выделения и изучения продуктов клеточного метаболизма, таких как гормоны, ферменты и антитела. Иммобилизованные поверхностно-активные клетки тканей животных играют все большую роль во многих областях биологии. Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуляции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также способствует изучению механизмов модификации клеточных функций под действием различных эффекторов, например лекарственных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужеродных веществ в печени [8].
4.1 Методы выделения и иммобилизации клеток
Большинство клеток твердых тканей, таких как ткани почек, печени, кожи, являются поверхностно-активными. В зависимости от подходов, используемых для прикрепления изолированных клеток к твердой подложке, или матрице, используют различные методики культивирования клеток тканей животных и человека. Из-за поверхностно-активных свойств invitro их можно культивировать только в виде тонких пластов или монослоев, непосредственно связанных с поверхностью подложки. Отдельные клетки, образующие этот монослой, контактируют как с соседними, так и с самой подложкой, поэтому их можно рассматривать как иммобилизованные. Однако, в отличие от иммобилизованных растительных клеток и ферментов, связывание между поверхностно-активными клетками млекопитающих и твердой подложкой обычно проводят без специальной физической или химической обработки. Это связывание осуществляется благодаря исходной активности препарата изолированных клеток, совместимости клеток с твердой подложкой, а также наличию в сыворотке или специально добавленных в среду веществ, способствующих связыванию клеток. Для некоторых видов клеток (например, клеток лимфобластоидного происхождения), обладающих особыми свойствами, разработана иная система культивирования. Клетки растут и размножаются в суспензии без предварительной иммобилизации, что облегчает разработку промышленных способов их культивирования [7].
При культивировании поверхностно-активных клеток требуется большая площадь поверхности носителя, а также адекватное и строго контролируемое поступление питательных веществ и кислорода, что вплоть до последнего времени сдерживало их крупномасштабное применение. Благодаря разработке методов культивирования на микроносителях, при которых клетки выращивают в виде монослоев, иммобилизованных на гранулах полистерола, стекла или декстрана, стало возможным культивирование поверхностно-активных клеток в суспензии. Жизнеспособные, чувствительные к действию эндогенных веществ (гормона) клетки можно выделить либо из нормальных, либо из патологических тканей человека или же из аналогичных тканей животных. В любом случае изолированные клетки получают, подвергая образцы тканей ферментативному диспергированию. При этом чтобы избежать некроза и получить максимальный выход жизнеспособных клеток, ткань следует измельчать как можно быстрее. Все операции следует проводить в стерильных условиях. Измельчение тканей начинают с приготовления срезов толщиной 0,5-1,0 мм с помощью микротома, успешно можно применять ножницы и пинцет (рис. 4.1) [9].
Рис. 4.1. Схема приготовления суспензии изолированных жизнеспособных клеток из свежеполученного образца ткани
Кроме того, из эпителиальных клеток выделяют особые факторы связывания, которые осуществляют прикрепление клеток к подложке, связывая гликопротеины клеточной поверхности с предварительно адсорбированными сывороточными или фибробластными гликопротеинами (рис. 4.2) [9].
Рис. 4.2. Прикрепление и организация в монослой свежеприготовленных клеток: А - молекулы гликопротеина, полученные из культурной среды, обогащенной сывороткой, адсорбируются на поверхности (электростатическое взаимодействие) лунки; Б - клетки, полученные из целой ткани оседают на поверхность лунки через 1-2 часа после нанесения;В - факторы связывания, полученные из клеток, прикрепляют клетки к поверхности, связывая сывороточные гликопротеины с гликопротеинами клеточной поверхности; Г - через 24 часа иммобилизованные клетки распластываются по поверхности, образуя монослой
Таким образом, иммобилизация клеток достигается благодаря первоначальному контакту и последующему распластыванию клеток на поверхности, в результате чего формируется монослой. Образование тесной связи между поверхностью клетки и подложкой и по существу структурная и функциональная стабильность монослоя в большей степени зависят от присутствия в среде гликопротеинов, способствующих прикреплению клеток. Общие принципы биотестирования. Широко используются иммобилизованные монослои клеток в системе биотестирования. Биотестирование - это оценка качественного и количественного содержания физиологически активных веществ (эффектора) по ответной реакции (тест-реакция) клеток-мишеней (тест-объект). Тест-объект (клетка, ткань, организм) - это жизнеспособные биологические структуры разных уровней организации. Тест-реакция характеризуется изменением какого-либо показателя под воздействием эффектора (стимулятора). Этот показатель получил название тест-параметра и определяется количественной характеристикой проявления тест-реакции.
Выбор клеток-мишеней, наиболее подходящих для биотеста на какое-либо определенное физиологически активное вещество, обуславливается как его природой исследуемого, так и стабильностью invitro и характеристиками ответа используемых клеток. В результате взаимодействия между стимулятором гормоном или медиатором и специфическими рецепторами соответствующих клетокмишений в нормальных условиях invivo происходят изменения в клеточном метаболизме: накапливаются метаболиты, расходуются вещества-предшественники, экскретируются в межклеточную среду специфические продукты метаболизма. Однако после извлечения тканей-мишеней из организма и ферментативного диспергирования изолированные клетки могут терять ряд специфических функциональных свойств, характерных для интактной ткани, и поэтому на препаратах иммобилизованных клеток не всегда возможно продемонстрировать полную последовательность функциональных ответов, обычно возникающих, например, при гормональной стимуляции исходной ткани. Тем не менее, во многих случаях при сохранении степени дифференцировки в условиях invitro, возможно выбрать несколько специфичных, ярко выраженных ответов клеток, на основе которых можно разработать метод биотестирования данного гормона. При изучении различных метаболических ответов, а также при выборе оптимального метода измерений биологической активности (биотестирования) данного физиологически активного вещества следует оценивать каждый из ответов по следующим четырем критерием:
- специфичность ответа;
- чувствительность ответа;
- точность определения в выбранном интервале доз гормона;
- воспроизводимость ответа при использовании клеточных препаратов;
В клинической и экспериментальной эндокринологии использование биотестов облегчает определение, например гормонов, как в здоровом, так и больном организме. В этой связи рассмотрим основные критерии и принципы, используемые при разработке и конструировании систем для биотестирования (в частности гормонов), а также дадим описание простейшего способа его реализации. Клетки, иммобилизованные на твердой подложке, представляют собой весьма удобный объект для выполнения различных операций биотестирования. Так, упрощаются процедуры введения контрольного и тестируемого стимуляторов. При этом клеточный монослой не нарушается, а «перенос» культуральной среды между инкубационными стадиями сведен до минимума. И, наконец, уникальная пространственная конфигурация клеток, организованных в монослои, способствует быстрому и одновременному действию стимулятора на все клетки культуры, благодаря чему достигается почти одинаковый объект всех клеток. К тому же если повторы культур структурно идентичны, то с помощью иммобилизованных клеток удается достичь высокой чувствительности биотестирования [9].
Заключение
биотестирование растительный полисахарид иммобилизация
Первое сообщение об иммобилизации растительных клеток в гранулированных полимерах появилось в 1979 г., и с тех пор количество подобных работ все растет. Считают, что с помощью иммобилизации можно частично или даже полностью преодолеть ряд основных затруднений, препятствующих крупномасштабному использованию растительных клеток.
Иммобилизованные растительные клетки могут быть использованы только для получения веществ, синтез которых не связан с ростом клеток, т. е. веществ, продуцируемых клетками в стационарной фазе. За счет более длительной стационарной фазы, наблюдаемой у иммобилизованных растительных клеток, можно решить ряд проблем, связанных с замедлением роста клеток (наработкой биомассы).
При культивировании растительных клеток происходит их агрегация, причем размеры агрегатов сильно варьируют, что затрудняет как перемешивание культуры, так и процессы массопереноса. Такого рода затруднения можно частично преодолеть с помощью иммобилизации, поскольку при этом агрегация не мешает, а, наоборот, помогает. Относительно гомогенный препарат гранул геля, содержащих клеточные агрегаты, получить нетрудно.
При длительном культивировании, сопровождаемом многократными пересевами, культуры растительных клеток часто претерпевают значительные изменения. Так, линии клеток, отобранные по признаку высокой продуктивности по определенному веществу, во многих случаях утрачивают эту способность. Данная проблема может быть до некоторой степени решена путем иммобилизации, поскольку у иммобилизованных клеток наблюдается удлинение стационарной фазы, а наработка продукта происходит, когда клетки находятся в неделящемся состоянии, т. е. в период наименее вероятного возникновения генетических изменений.
Проблему низкой механической устойчивости растительных клеток удается решить путем включения клеток в защитную полимерную матрицу, благодаря чему упрощается конструкция реактора. Еще одно преимущество иммобилизованных растительных клеток - это возможность индуцированной экскреции веществ, накопленных внутри клетки, с помощью периодической пермеабилизации, что может оказаться полезным для дальнейшей разработки технологии культивирования растительных тканей. При этом биомассу можно использовать многократно в течение достаточно длительного времени.
Результаты применения иммобилизованных растительных клеток, полученные к настоящему времени, весьма обнадеживают. По-видимому, иммобилизация представляет собой перспективный метод, с помощью которого удастся частично или полностью решить проблемы, связанные с использованием культур растительных тканей для получения сложных органических соединений [10].
Литература
1. Березин И.В., Иммобилизованные ферменты [Текст] / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов // М.: Высш. шк.- 1987. - 159 с.
2. Бодей С.П., Иммобилизованные клетки и ферменты[Текст] / С.П. Бодей, П. Броделиус, И.М. Кабрал // М.: Мир. - 1988.- с. 81-85.
3. Бутенко Р.Г., Биология клеток высших растений invitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко // М.: ФБК-ПРЕСС.- 1999.- 144 с.
4. Степанов Э.Ф., Применение иммобилизованных ферментов /Э.Ф. Степанов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ. - 1986.- с. 23-26.
5. Синицын А.П., Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын, Е.И. Райнина, В.И. Лозинский, С.Д. Спасов // М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1994.- 138 с.6. Юрин В.М., Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин // Минск: БГУ. - 2006.- с. 152-155.
7. Валиханова Г.Ж., Биотехнология растений / Г.Ж. Валиханова // Алматы: Конжык. - 1996.- 44 с.
8. Корочинский А.В., Исследование возможности создания иммобилизованных структур на базе пробиотиков / А.В. Корочинский, В.В. Верниковский, Э.Ф. Степанова // Успехи современного естествознания.- 2010.- с. 34- 38.
9. Скрябин Г.К., Иммобилизованные клетки микроорганизмов Биотехнология / Г.К. Скрябин, К.А. Кощеенко // - М.: Наука.- 1984.- с. 89-91.
10. Тривен М., Иммобилизованные ферменты / М. Тривен // М.: Мир. -1983.- 121 с.