Статья: Индукция прямой регенерации побегов при генетической трансформации табака штаммом К599 Agrobacterium rhizogenes

Индукция прямой регенерации побегов при генетической трансформации табака штаммом к599 agrobacterium rhizogen.es

Э.А. Баймухаметова, З.А. Бережнева, Х.Г. Мусин, Д.Ю. Швец, А.В. Князев, Б.Р. Кулуев

Аннотация

Кукумопиновый штамм К599 Agrobacterium rhizogenes чаще всего используется для получения волосовидных корней труднотрансформируемых растений семейства Бобовые, однако фенотипическое проявление трансформации этим штаммом у более чувствительных к агробактериям видов остается неизученным. В работе проведена генетическая трансформация листовых дисков табака Nicotiana tabacum L. штаммом К599 A. rhizogenes, результатом которой стало спонтанное каллусо- и побегообразование на безгормональных средах. В среднем на один листовой эксплант приходилось шесть побегов-регенерантов. Образовывались также волосовидные корни, но их было крайне мало - в среднем 0.77 корней на эксплант. Изолированные культуры волосовидных корней табака, полученные при помощи штамма К599, фенотипически не отличались от таковых, полученных с использованием штаммов А4 и 15834. ПЦР-анализ показал наличие rol-генов во всех трансгенных растениях, регенерировавших спонтанно или индуцированных на корнях регуляторами роста. На основе полученных данных сделан вывод, что штамм К599 в отличие от других штаммов A. rhizogenes может быть использован для получения трансгенных растений табака на безгормональных питательных средах путем прямой регенерации побегов на эксплантах.

Ключевые слова: агробактериальная трансформация, волосовидные корни, hairy roots, регенерация, каллусообразование, ризогенез, трансгенные растения

Abstract

Inducing Direct Shoot Regeneration during the Genetic Transformation
of Tobacco with Agrobacterium rhizogenes Strain K599

E.A. Baimukhametova , Z.A. Berezhneva , Kh.G. Musin , D.Yu. Shvets , A.V. Knyazev , B.R. Kuluev

This article is devoted to the study of the phenotypic manifestations of transformation induced by the Agrobacterium rhizogenes strain K599 in Nicotiana tabacum L., a model plant sensitive to agrobacteria. For this purpose, we carried out a genetic transformation of tobacco leaf disks that resulted in spontaneous callus and shoot formation on hormone-free media. On average, 6 regenerated shoots per leaf explant were obtained. Overall, 2 out of 87 transplanted shoots spontaneously formed roots, and 21 shoots died. In the remaining shoots, rooting was observed only when the growth regulator IAA was added to the medium. Using the above protocol, a total of 39 transgenic plantlets adapted to the given soil conditions were produced from spontaneous points of regeneration. The transformation also initiated the formation of hairy roots, but there were very few of them - 0.77 roots per explant on average. The isolated cultures of tobacco hairy roots generated using strain K599 did not phenotypically differ from those induced by strains A4 and 15834. On the hairy roots, 10 shoots transgenic for rol genes were regenerated by the induction of shoots using growth regulators, 8 of them were later rooted and acclimated to the given soil conditions. The PCR analysis showed the presence of rol genes in all transgenic plants that regenerated spontaneously or were induced on roots by growth regulators. Thus, strain K599, unlike other strains of A. rhizogenes, has a potential to be used to grow transgenic tobacco plants on hormone-free nutrient media by direct regeneration of shoots on explants.

Keywords: Agrobacterium-mediated transformation, hairy roots, regeneration, callus formation, rhizogenesis, transgenic plants

Введение

Agrobacterium rhizogenes, также известный как Rhizobium rhizogenes [1, 2], - вид грамотрицательных, облигатно аэробных почвенных бактерий семейства Rhizobiaceae, способных заражать более 140 видов двудольных растений и вызывать у них образование на месте ранения так называемых волосовидных (косматых, бородатых) корней (англ. hairy roots, HRs) [3], что обусловлено наличием крупной Ri-плазмиды, размер которой у различных штаммов варьирует от 200 до 800 т.п.н. [4]. Ri-плазмида агробактерий содержит генный локус rol (англ. root locus), включающий гены rolA, rolB, rolC и иногда rolD. Данные гены в составе Т-ДНК Ri-плазмиды встраиваются в геном клетки-хозяина и являются главными генетическими детерминантами образования волосовидных корней, а также причиной такого заболевания растений, как “hairy root” [5].

Примечательно, что волосовидные корни продолжают свой рост и развитие после отделения от материнского экспланта. Изолированные культуры волосовидных корней характеризуются быстрым и неограниченным ростом, генетической и фенотипической однородностью, что делает их перспективными для использования в биотехнологических производствах для продукции различных ценных метаболитов [6-8]. Так, за последние 40 лет для генетической трансформации растений с целью получения волосовидных корней было использовано до 90 различных штаммов ризогенных агробактерий, причем наиболее популярными являются агропиновые штаммы А4 и 15834. Приблизительно в каждой шестой работе сообщается об использовании штамма LBA9402. Еще три штамма - Я1000, К599 (также известный как штамм NCPPB2659) и NCШ8196 - применялись немногим чаще остальных [8]. Прочие штаммы использовались в основном в единичных случаях. Однако нет полной уверенности, что это именно разные штаммы, а не разные обозначения одних и тех же штаммов.

Стоит отметить, что различные штаммы агробактерий могут вызывать различные фенотипические изменения в результате генетической трансформации. Так, было показано, что волосовидные корни табака, полученные с помощью штамма А4 А. rhizogenes, являются более разветвленными, а образование новых волосовидных корней на семядольных эксплантах происходит в течение двух месяцев после трансформации, тогда как при использовании штамма 15834 новые корни способны формироваться только в течение первого месяца. Корням, полученным с помощью двух типов штаммов, помимо плагиотропного роста, присуще быстрое ветвление на фоне плохо выраженного апикального роста кончиков корней, что приводит к очень плотному переплетению образующихся боковых корней [8].

Менее изученным является штамм К599, на сегодняшний день он наиболее эффективен для получения волосовидных корней бобовых - культур труднотрансформируемых ризогенными агробактериями. Так, с использованием этого штамма удалось получить волосовидные корни нута бараньего [ 9] и чечевицы обыкновенной [10]. Однако работ с подробным описанием фенотипических особенностей генетической трансформации этим штаммом небобовых растений мы не нашли. К примеру, в опытах с агробактериями часто используют модельный объект - табак МеоНапа tabacum L., у которого при агробактериальной трансформации листовых эксплантов штаммами А4 и 15834 уже через две недели индуцируется обильное корнеобразование на безгормональных питательных средах [11]. В случае изолированного культивирования эти корни сильно разрастаются и обладают довольно высокой способностью к регенерации побегов, но только при добавлении в питательную среду ауксинов (НУК) и цитокининов (6-БАП), что говорит о возможности регенерации трансгенных растений на волосовидных корнях под действием гормонов после трансформации ризогенными агробактериями [12]. Можно полагать, что эффект штамма К599 при агробактериальной трансформации табака будет несколько отличаться от такового при условии использования агропиновых штаммов. Поэтому цель настоящего исследования - выяснение особенностей генетической трансформации табака при помощи штамма К599 А. rhizogenes и определение эффективности регенерации трансгенных побегов из культур волосовидных корней.

Материалы и методы

В работе использовали кукумопиновый штамм К599 A. rhizogenes (NCPPB2659) с Ri-плазмидой pRi2659 (185462 п.н.) с Т-ДНК 14982 п.н. (номер доступа: EU186381). Культуры HRs были созданы из листовых эксплантов двухмесячных растений табака N. tabacum L. сорта Petit Havana линии SR1. Агробактерии предварительно выращивали при 28 °С в течение 15 ч в жидкой питательной среде LB (Lysogeny broth), содержащей в качестве селективного антибиотика стрептомицин (100 мг/л). Полученную агробактериальную суспензию центрифугировали при 4000 об/мин в течение 5 мин, осадок растворяли в 5 мл питательной среды minA (состав на 100 мл: 1.37 г K2HPO4, 0.45 г KH2PO4, 0.1 г (NH4)2SO4, 0.05 г цитрат натрия, 0.025 г MgSO4-7H2O, 0.2 г глюкоза) с добавлением ацетосирингона 100 мкМ и наращивали в течение 2 ч при 25 °С 180 об/мин. Экспланты листьев табака стерилизовали с использованием 70%-ного раствора этилового спирта (~1 мин) и 10%-ного раствора гипохлорита натрия (~10 мин). Затем экспланты нижней стороной листа вверх помещали на чашку Петри, содержащую 10 мл жидкой среды Мурасиге - Скуга (МС) и 1 мл агробактериальной суспензиии, и инокулировали в течение 25-30 мин, после чего переносили на питательную среду для сокультивирования, предварительно подсушивая на стерильной фильтровальной бумаге. Совместное культивирование листовых эксплантов агробактериями проводили на твердой (7 г/л агара) среде МС [13] в течение 2 сут при температуре +26 °С, после чего листовые экспланты переносили на твердую среду МС, содержащую антибиотик цефотаксим (100 мг/л). Все образовавшиеся волосовидные корни и спонтанно-образующиеся побеги-регенеранты отделяли от эксплантов, помещали в отдельные чашки Петри со средой МС и содержали при температуре воздуха +24 ± 1 °С. Для укоренения побегов использовали среду МС, дополненную индолилуксусной кислотой (ИУК) (0.2 мг/л). Регенерацию побегов на волосовидных корнях индуцировали при помощи регуляторов роста 6-БАП (1 мг/л) и НУК (0.5 мг/л). Волосовидные корни держали в темноте, а побеги-регенеранты на свету (100 рмоль/м-с, фотопериод 16 ч). Геномную ДНК из волосовидных корней и побегов-регенерантов выделяли стандартным CTAB-методом. С целью подтверждения трансгенности корней и побегов использовали классический метод ПЦР с универсальными праймерами RolABIF AATTGCTACGAGGGGACGCTTTGT/

Рис. 1. Результаты трансформации листовых эксплантов табака штаммом К599 А. rhizogenes: а - начало регенерации побегов на листовых эксплантах через 17 дней после инокуляции агробактериями; б - волосовидный корень через 28 дней после инокуляции агробактериями (отмечен стрелкой); в - культуры волосовидных корней через 20 дней после изоляции от листовых эксплантов; г - побеги-регенеранты через 14 дней после изоляции от листовых эксплантов

RolABIR ACGCTCCGCCGGTGGTCATACTTA,

RolAB2F TCGGCGGGCTAAGGTCAAGAA/

RolAB2R CTCGCGAGAAGATGCAGAAAGTA, подобранными нами в рамках настоящего исследования для одновременной детекции генов rolA и rolB. Для ПЦР-анализа использовали также универсальные праймеры rolC1F GGCGCACTCCTCACCAACCTTC и rolC1R CTCGCCATGCCTCACCAACTCA, подобранные для детекции гена rolC в различных штаммах A. rhizogenes.

Перед адаптацией растений к почвенным условиям побеги с хорошо сформированными корнями вынимали из питательной среды и тщательно очищали от ее остатков, аккуратно промывая корни под проточной водой. Затем растения высаживали на почвенный субстрат, покрывали пленками для сохр анения влажных условий и выращивали при температуре 26 ± 1 °С на свету. волосовидный листовый табак генетический

Результаты и их обсуждение

После инокуляции табака с агробактериями штамма К599 на листовых эксплантах уже через 10-12 дней начинали появляться спонтанные точки регенерации (рис. 1, а). Побегообразование шло по всей поверхности листовых дисков. Появление волосовидных корней происходило лишь на 18 -й день после трансформации, причем корней было крайне мало, и росли они медленнее побегов. В среднем, на один эксплант приходилось лишь 0.77 корней, в то время как число побегов-регенерантов составило примерно 6 (рис. 1).

Через 45 дней подросшие побеги отсоединяли от материнского экспланта и пересаживали на питательную среду МС стандартного состава. Так как индукция образования и регенерации побегов происходила на безгормональной среде, интересной представлялась дальнейшая возможность культивирования побегов на этих же средах. Успешное укоренение свидетельствовало бы о том, что с помощью штамма A. rhizogenes К599 можно получать трансгенные растения без использования каких-либо регуляторов роста. Всего на свежую питательную среду был о пересажено 87 наиболее крупных здоровых побегов из 175, образовавшихся на 30 эксплантах, использованных в работе. Среди пересаженных побегов лишь 2 через 10 дней пустили корни, при этом 21 побег погиб во время культивирования от повышенной активности агробактерий. Оставшиеся 66 побегов через 2 недели культивирования пересадили на среду с гормоном ИУК (0.2 мг/л), из них была выделена ДНК и проведен ПЦР-анализ на наличие генов гоІА, гоІВ, го1С, который показал, что 64 растения, в том числе 2 растения, укоренившихся на безгор- мональной среде, то есть 96.97% всех прямых побегов-регенерантов, содержат го1-гены (рис. 2-4). Подросшие побеги с хорошей корневой системой в количестве 55 растений высаживали на почвенный субстрат, однако лишь 39 из них смогли адаптироваться к почвенным условиям. Полученные растения имели фенотип, характерный для растений, трансгенных по гоІ-генам: темно-зеленые морщинистые листья и укороченные междоузлия. Всего было укоренено 63.21% прямых побегов-регенерантов (от общего числа пересаженных побегов) и акклиматизированы к условиям почвы 44.83% побегов (табл. 1).

Табл. 1 Число индуцированных побегов-регенерантов, полученных в ходе работы

Таким образом, в отличие от трансформации штаммами А4 и 15834 А. rhizogenes, после которой на эксплантах табака уже через одну неделю на жилках листа начинают появляться исключительно волосовидные корни, не менее 8-10 на один эксплант, и совсем не происходит побегообразования [11], в данном эксперименте преимущественно идет именно прямая регенерация побегов, причем на безгормональных средах, а волосовидные корни образуются гораздо медленнее.

Образующиеся волосовидные корни высаживали на свежую питательную среду одновременно с побегами. После пересадки корни начинали расти гораздо более интенсивно, быстро ветвились и по основным фенотипическим характеристикам уже не отличались от волосовидных корней, образованных штаммами А4 и 15834 (рис. 1, в) [12]. ПЦР-анализ показал наличие гоІ-генов во всех 23 проанализированных линиях волосовидных корней К599. Интересно, что через две недели на изолированных культурах волосовидных корней спонтанно начинали регенерировать новые побеги (рис. 5, а), причем на безгормональной среде МС. В первую неделю роста эти новые побеги-регенеранты были почти белые, так как они помещались в темноту для стимуляции роста волосовидных корней. В ходе дальнейших этапов эксперимента побеги постепенно приобретали зеленую окраску на свету. Эти побеги отделяли от корней и пересаживали на новые среды без фитогормонов, и часть из них (3 побега) спонтанно образовали корни (рис. 5, б). Оставшиеся побеги пересаживали на среды с ИУК с целью укоренения и получения трансгенных растений. Однако все эти побеги демонстрировали пла- гиотропный рост корней (рис. 5, в, г). Более того, индукция корней на этих побегах шла не только на стеблях, но и на листьях.

Табл. 2 Получение трансгенных растений из побегов-регенерантов