Такое повышенное корнеобразование у побегов-регенерантов было не характерно для растений, полученных с помощью штаммов А4 и 15834 [11, 12]. Далее все плагиотропно растущие корни с этих побегов удаляли, оставляли только корни, растущие геотропно. В итоге было получено 7 укоренившихся побегов, 5 из которых были акклиматизированы к условиям почвы. ПЦР-анализ показал наличие в них генов гоІА, гоІВ и отсутствие гена гоІС (рис. 6, табл. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа с праймером RolABl: 1-66 - прямые побеги-регенеранты; М - маркер длин ДНК 1kb DNA Ladder; -К - отрицательный контроль ПЦР. Размер ПЦР-продукта - 1112 п.н.
Рис. 3. Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа с праймером RolAB2: М - маркер длин ДНК 1kb DNA Ladder; 1-66 - прямые побеги-регенеранты; -К - отрицательный контроль ПЦР. Размер ПЦР-продукта - 1127 п.н.
Рис. 4. Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа с праймером RolCl: М - маркер длин ДНК 1kb DNA Ladder; 1-66 - прямые побеги-регенеранты; +К - положительный контроль ПЦР. Размер ПЦР-продукта - 267 п.н.
Рис. 5. Спонтанная регенерация побегов на изолированных культурах волосовидных корней: а - регенерация побегов на изолированных культурах волосовидных корней на среде без фитогормонов; б - ризогенез на побегах-регенерантах на среде без фитогормонов; в, г - плагиотропный рост корней на побегах-регенерантах на средах с ИУК
Рис. 6. Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа с праймерами: а - RolCl, размер продукта 267 п.н.; б - RolABl, размер продукта 1112 п.н.; в - RolAB2, размер продукта 1127 п.н.; М - маркер длин ДНК 1kb DNA Ladder; 1-7 - спонтанно регенерировавшие на корнях побеги; -К - отрицательный контроль ПЦР; +К - положительный контроль ПЦР
Стоит отметить, что в случае использования штаммов А4 и 15834 спонтанная регенерация побегов на изолированных культурах волосовидных корней не регистрировалась, а побегообразование индуцировалось исключительно при добавлении в питательные среды регуляторов роста 6-БАП и НУК [11]. Аналогичный результат наблюдался и в наших экспериментах при помещении корней после трансформации штаммом К599 на среду с данными гормонами. Через неделю культивирования начиналось интенсивное каллусообразование (рис. 7, а). Еще через 10 дней на каллусах начинался геммогенез (рис. 7, б). Однако в случае со штаммом К599 геммогенез шел менее эффективно, чем в случаях со штаммами А4 и 15834 [12]. Во-первых, образовывалось меньше побегов, во-вторых, часть из них была гидратирована (рис. 7, б). Путем индукции побегообразования комбинацией гормонов 6-БАП и НУК нам удалось получить 10 побегов (рис. 7, в), трансгенных по га/-генам (рис. 8), 8 из которых в дальнейшем были укоренены и акклиматизированы к почвенным условиям (табл. 2).
Рис. 7. Каллусо- и побегообразование на волосовидных корнях табака после помещения их на среды с гормонами 6-БАП и ИУК: а - каллусообразование на волосовидных корнях на средах с 6-БАП и НУК; б - геммогенез на каллусах, полученных от волосовидных корней; в - акклиматизированное к условиям почвы растение-регенерант (слева) по сравнению с диким типом (справа)
Рис. 8. Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа с праймерами: а - RolABl, размер продукта 1112 п.н.; б - RolAB2, размер продукта 1127 п.н.; в - RolCl, размер продукта 267 п.н.; М - маркер длин ДНК 1kb DNA Ladder; 1-10 - побеги, регенерировавшие на корнях с помощью гормонов; -К - отрицательный контроль ПЦР; +К - положительный контроль ПЦР
Регенеранты, акклиматизированные к почвенным условиям, имели фенотип, характерный для растений, трансгенных по го/-генам. Например, они имели ярко выраженную кустистость, карликовость, темно-зеленые вытянутые морщинистые листья, короткие междоузлия (рис. 7, в).
На основе результатов, полученных в ходе экспериментов, можно сделать вывод, что уникальность штамма К599 A. rhizogenes заключается в способности при трансформации индуцировать прежде всего побегообразование. При этом возможно прямое получение трансгенных растений без длительного этапа каллу- сообразования из листовых эксплантов на безгормональных средах. Мы показали передачу rol-генов в эти растения, поэтому можно полагать, что при дополнительном использовании бинарных векторов вполне могут быть получены трансгенные растения, экспрессирующие другие целевые гены, внедренные в составе бинарных векторов в клетки A. rhizogenes с помощью метода электропорации [14]. Одним из препятствий для широкого использования данного подхода является то, что образующиеся трансгенные растения могут содержать rol-гены, со всеми нежелательными последствиями в виде фенотипа hairy root. Поэтому трансгенные побеги после трансформации должны быть проверены ПЦР-анализом на наличие целевого гена и rol-генов. При этом существует вероятность того, что трансгенное растение не будет содержать rol-гены, в противном случае следует отбирать трансформанты с наименьшим проявлением фенотипа hairy root [15].
Таким образом, при агробактериальной трансформации листовых эксплантов табака с помощью штамма К599 A. rhizogenes в отличие от штаммов А4 и 15834 активируется не только ризогенез, но прежде всего геммогенез. Из прямых регенерантов побегов, полученных при генетической трансформации штаммом К599, могут быть получены полноценные трансгенные растения, акклиматизированные к условиям почвы. Методом ПЦР-анализа доказано наличие трансгенов во всех волосовидных корнях большинства прямых регенерантов и растений, полученных при регенерации из волосовидных корней. Это означает, что штамм К599 A. rhizogenes может быть использован для быстрого создания трансгенных растений табака, минуя стадию каллусообразования на безгормональных питательных средах.
Литература
1. Young J.M., Kuykendall L.D., Martmez-Romero E., Kerr A., Sawada H. A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R. vitis // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2001. - V. 51, No 1. - P. 89-103.
2. Flores-Fйlix J.D., Menйndez E., Peix A., Garc^a-Fraile P., Velвzquez E. History and current taxonomic status of genus Agrobacterium // Syst. Appl. Microbiol. - 2020. - V. 43, No 1. - P. 126046-126062.
3. Smith E.F., Townsend C.O. A plant-tumor of bacterial origin // Science. - 1907. - V. 25, No 643. - P. 671-673.
4. Costantino P., Mauro M.L., Micheli G., Risuleo G., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.
5. Fingerprinting and sequence homology of plasmids from different virulent strains of Agrobacterium rhizogenes // Plasmid. - 1981. - V. 5, No 2. - P. 170-182.
6. Levesque H., Delepelaire P., Rouze P., Slightom J., Tepfer D. Common evolutionary origin of the central portions of the Ri TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes and the Ti T-DNAs of Agrobacterium tumefaciens // Plant Mol. Biol. - 2009. - V. 11, No 6. - P. 731-744.
7. Srivastava S., Srivastava A.K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites // Crit. Rev. Biotechnol. - 2007. - V. 27, No 1. - P. 29-43.
8. Stoger E., Fischer R., Moloney M., Ma J.K.-C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases // Annu. Rev. Plant Biol. - 2014. - V. 65. - P. 743-768.
9. Кулуев Б.Р., Вершинина З.Р., Князев А.В., Чемерис Д.А., Баймиев АнХ., Чумаков М.И., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. «Косматые» корни растений - важный инструментарий для исследователей и мощная фитохимбиофабрика для производственников // Биомика. - 2015. - № 2. - С. 70-120.
10. Aggarwal P.R., Nag P., Choudhary P., Chakraborty N., Chakraborty S. Genotype-independent Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation of chickpea: A rapid and efficient method for reverse genetics studies // Plant Methods. - 2018. - V. 14. - Art. 55, P. 1-13.
11. Foti C., Pavli O.I. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy root induction of Lens culinaris // Agronomy. - 2020. - V. 10, No 8. - Art. 1170, P. 1-11.
12. Гумерова Г.Р., Чемерис А.В., Никоноров Ю.М., Кулуев Б.Р. Морфологический и молекулярный анализ изолированных культур адвентивных корней табака, полученных методами биобаллистической бомбардировки и агробактериальной трансформации // Физиология растений. - 2018. - Т. 65, № 5. - С. 376-387.
13. Knyazev A.V., Kuluev B.R., Fateryga A.V., Yasybaeva G.R., Chemeris A.V. Aseptic Germination and Agrobacterium rhizogenes-mediated Transformation of Taraxacum hyber- num Steven // Plant Tissue Cult. Biotechnol. - 2017. - V. 27, No 2. - P. 141-151.
14. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures // Plant Physiol. - 1962. - V. 15, No 3. - P. 473-497.
15. Knyazev A.V., Kuluev B.R., Vershinina Z.R., Yasybaeva G.R., Chemeris A.V. Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in Parasponia andersonii Planch // Asian J. Plant Sci. - 2017. - V. 16, No 4. - P. 227-234.
16. Kuluev B.R., Knyazev A. V., Mikhaylova E. V., Ermoshin A.A., Nikonorov Y.M., Chemeris A. V. The poplar ARGOS-LIKE gene promotes leaf initiation and cell expansion, and controls organ size // Biol. Plant. - 2016. - V. 60, No 3. - P. 513-522.
References
1. Young J.M., Kuykendall L.D., Martinez-Romero E., Kerr A., Sawada H. A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola de Lajudie et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R. vitis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, vol. 51, no. 1, pp. 89-103.
2. Flores-Fйlix J.D., Menйndez E., Peix A., Garcla-Fraile P., Velazquez E. History and current taxonomic status of genus Agrobacterium. Syst. Appl. Microbiol., 2020, vol. 43, no. 1, pp. 126046-126062.
3. Smith E.F., Townsend C.O. A plant-tumor of bacterial origin. Science, 1907, vol. 25, no. 643, pp. 671-673.
4. Costantino P., Mauro M.L., Micheli G., Risuleo G., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R. Fingerprinting and sequence homology of plasmids from different virulent strains of Agrobacterium rhizogenes. Plasmid, 1981, vol. 5, no. 2, pp. 170-182.
5. Levesque H., Delepelaire P., Rouzй P., Slightom J., Tepfer D. Common evolutionary origin of the central portions of the Ri TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes and the Ti T-DNAs of Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol. Biol., 2009, vol. 11, no. 6, pp. 731-744.
6. Srivastava S., Siivastava A.K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Crit. Rev. Biotechnol., 2007, vol. 27, no. 1, pp. 29-43.
7. Stoger E., Fischer R., Moloney M., Ma J.K.-C. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. Annu. Rev. Plant Biol., 2014, vol. 65, pp. 743-768.
8. Kuluev B.R., Vershinina Z.R., Knyazev A.V., Chemeris D.A., Baimiev An.Kh., Chumakov M.I., Baimiev Al.Kh., Chemeris A.V. “Hairy” plant roots - an important tool for researchers and a powerful phytochemical biofactory for industrial workers. Biomika, 2015, no. 2, pp. 70-120. (In Russian)
9. Aggarwal P.R., Nag P., Choudhary P., Chakraborty N., Chakraborty S. Genotype-independent Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation of chickpea: A rapid and efficient method for reverse genetics studies. Plant Methods, 2018, vol. 14, art. 55, pp. 1-13.
10. Foti C., Pavli O.I. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy root induction of Lens culinaris. Agronomy, 2020, vol. 10, no. 8.
11. Gumerova G.R., Chemeris A.V., Nikonorov Yu.M., Kuluev B.R. Morphological and molecular analysis of isolated cultures of tobacco adventitious roots obtained by the methods of biolistic bombardment and Agrobacterium-mediated transformation. Plant Physiol., 2018, vol. 65, no. 5, pp. 740-749.
12. Knyazev A.V., Kuluev B.R., Fateryga A.V., Yasybaeva G.R., Chemeris A.V. Aseptic germination and Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of Taraxacum hybernum Steven. Plant Tissue Cult. Biotechnol., 2017, vol. 27, no. 2,
13. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol, 1962, vol. 15, no. 3, pp. 473-497.
14. Knyazev A.V., Kuluev B.R., Vershinina Z.R., Yasybaeva G.R., Chemeris A.V. Agrobacterium rhizogenes mediated hairy root induction in Parasponia andersonii Planch. Asian J. Plant Sci., 2017, vol. 16, no. 4, pp. 227-234.
15. Kuluev B.R., Knyazev A.V., Mikhaylova E.V., Ermoshin A.A., Nikonorov Y.M., Chemeris A.V. The poplar ARGOS-LIKE gene promotes leaf initiation and cell expansion, and controls organ size. Biol. Plant., 2016, vol. 60, no. 3, pp. 513-522.