Материал: Использование фрактального анализа плавательной активности Daphnia Magna для оценки токсичности

осуществлении государственного экологического мониторинга водных объектов, прежде всего, в районах расположения источников антропогенного воздействия;

проведении экологической экспертизы новых технологий материалов, проектов очистных сооружений, реконструкций и технологического перевооружения народно-хозяйственных объектов;

проведение оценки состояния водных экосистем [2].

Выбор метода биотестирования зависит от поставленной задачи (рис. 1).

Рис. 1. Схема методов биотестирования А.Г. Бубнова.

Биотестирование успешно применяется для индикации токсичности сточных вод. В нормативных документах прописано, что сточная вода при сбросе в водный объект не должна вызывать острого токсического воздействия на тест-объекты. Для этого необходимо определить кратность разбавления сточной воды, при которой она не будет вызывать острого токсического воздействия. Для разбавления используют воду из водоема, взятую вне зоны воздействия проверяемой сточной воды.

Для решения задач по уменьшению токсического загрязнения природных вод рекомендованы к эксплуатации специальные приборы биотестирования, пригодные для использования в производственных условиях непосредственно в местах сброса сточных вод. Для токсикологической паспортизации водных объектов используются портативные переносные устройства. Они дают возможность проводить быстрые массовые токсикологические анализы. Биосигнализаторы токсичности работают автономно, непрерывно контролируя сточные воды в месте сброса в водные объекты. Они помогают узнать о случаях нарушения технологического процесса, аварийных ситуациях, что, в свою очередь, позволяет вовремя предотвратить или максимально снизить загрязнение водных объектов.

Биотестирование природных вод имеет ряд отличий от биотестирования сточных вод. Для верного определения качества воды в водном объекте, необходимо взять пробы, максимально подходящие для достижения поставленной задачи.

Различают пробы простые (отражают состояние водного объекта в момент отбора пробы) и смешанные (показывают среднее содержание в воде определяемых компонентов), разовые и регулярные.

Место отбора выбирается в зависимости от задачи анализа и на основании исследования местности.

Пробы отбираются с глубины 20-30 см от поверхности с помощью специальных приборов - батометров.

Пробы хранятся в стеклянной или полиэтиленовой посуде при температуре +4 градуса не более суток.

.3 Дафнии как тест-объекты в биотестировании

В качестве тест-объектов в водной токсикологии широко используются планктонные ветвистоусые ракообразные (Cladocera), в частности дафнии (лат. Daphnia).

Это обусловлено прежде всего тем, что:

род Daphnia имеет очень широкое распространение в пресных водах и является ключевым звеном во многих водных пищевых цепях;

вследствие прозрачности тела дафний, есть возможность визуального наблюдения за качеством эмбрионов, скоростью их созревания, темпом размножения, а также оценки физиологического состояния (сердцебиения, наполнения кишечника и т.д.) тест-объекта;

есть возможность регулярной оценки народившейся молоди по ее морфологическим признакам, а также по выживаемости от родительского к дочерним поколениям;

род Daphnia имеет относительно короткий жизненный цикл, что особенно важно для тестов на плодовитость;

род Daphnia используется как один из наиболее чувствительных индикаторов (датчиков) присутствия в водной среде тяжелых металлов и фосфорорганических пестицидов [9].

Наиболее универсальным тест-объектом по чувствительности и адекватности реагирования на различные токсиканты признан вид Дафний - Daphnia magna Straus [9].

Рис.2. Daphnia magna Straus - внешний вид

Впервые этот вид Daphnia как тест-объект был использован в работе Э.Наумана в 1933 году. Дафнии широко применяются в биотестировании в таких странах мира, как США, Германия, Франция, Венгрия и др. Во многих из них дафния принята как стандартный тест-организм. В СССР начало подобных работ связано с исследованиями Н.С. Строгонова и его школы, Е.А. Веселова и Л.А. Лесникова. Дафнии как обязательный тест-объект включены в схему установления ПДК веществ-загрязнителей и сточных вод России [10].magna Straus имеет серо-желтую или красноватую окраску (при дефиците кислорода), не превышает 2-3 мм в длину, обитает в водоёмах, прудах, озерах почти повсеместно.

При благоприятных условиях в лаборатории дафнии большую часть года размножаются без оплодотворения, т.е. партерогенетически, производя потомство, состоящее из самок. Период созревания рачков при температуре 20±2 оС и хорошем питании - 5-8 дней. Длительность эмбрионального развития обычно 3-4 дня. По истечении этого времени происходит вымет молоди. Партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 дня [10].

Для культивирования дафний используется биологизированная вода из аквариума, кормом служат зеленые водоросли (хлорелла). Культуру выращивают в специальном климостате при температуре 20±2 оС и освещенности 400-600 лк при продолжительности светового дня 12-14 часов.

В токсикологических исследованиях на дафниях различают кратковременное (до 96 часов) и длительное (20 и более суток) биотестирование. Кратковременное биотестирование рассчитано на получение экспресс информации о состоянии проверяемого водоема, где основным показателем служит выживаемость гидробионта. Для более глубокого и тщательного исследования используют длительное биотестирование. Оно позволяет долговременный эффект действия токсикантов.

Большинство методов биотестирования с использованием дафний основывается на регистрации их смертности под воздействием загрязняющих веществ. Но еще до гибели тест-объектов токсиканты влияют на изменение их поведенческой активности. Под воздействием поллютантов у дафнии наблюдается либо резкое повышение двигательной активности, либо наоборот замедление. Таким образом фиксирование изменения плавательной активности дафний позволяет на ранней стадии определить токсичность воды.

Также было проведено несколько работ, в которых ставилось предположение, что траектория плавания дафнии является фрактальной структурой, а при внесении токсиканта фрактальная размерность меняется. (Shimizu, 2001).

Фрактал - математическое множество, обладающее свойством самоподобия, то есть однородности в различных шкалах измерения. Самоподобие является весьма общим свойством природных систем: бассейны крупных рек, пространственная структура колоний микроорганизмов и др. - обладают удивительной структурной универсальностью. Часто в этой связи говорят о фрактальности природных объектов. Термин «фрактал» и первые исследования с его использованием были проведены Бенуа Мандельбротом.

Фрактальная размерность - это мера геометрической сложности объекта. Следуя идее Мандельброта, фрактальную размерность можно определить методом подсчёта квадратов. Представим себе объект сложной формы, который сплошь покрыт квадратами, как миллиметровая бумага. Часть квадратов будет содержать элементы множества, другие квадраты будут пустыми. Число непустых клеток N зависит от формы объекта и от размеров квадратной ячейки E. Постулируется, что N пропорционально 1/ED (чем мельче решётка, тем больше непустых ячеек). Показатель степени D и является размерностью объекта. Например, для такой сплошной плоской фигуры, как круг, уменьшение размера решётки вдвое приведёт к увеличению количества непустых клеток в четыре раза (два в квадрате), потому что фигура обладает размерностью два. Для фрактала количество непустых клеток будет возрастать с несколько меньшим, дробным показателем степени. Описанная процедура не ограничивается математическими объектами или формами на плоскости. Аналогичным образом можно подсчитать фрактальную размерность реальных объектов, таких, как реки, облака, береговые линии, артерии или реснички, покрывающие стенки кишечника. Артерии человека, например, имеют фрактальную размерность порядка 2,7 [13].

Фрактальная размерность рассчитывается по формуле Каца и Георгия (1985):

FD= log (N)/ [log (N) +log (D/L)],

где L - это общая длина плавательной траектории, D - это диаметр описанной траектории, N - количество сегментов.

В качестве токсиканта был использован пестицид Esfenvalerate. Представляет собой химическое действующее вещество пестицидов (пиретроид), используется в сельском и личных приусадебных хозяйствах для борьбы с вредными насекомыми.

Препараты на основе эсфенвалерата проявляют сильную поражающую активность как при наружном контакте, так и при попадании в пищеварительную систему членистоногих вредителей. Защита растений происходит также при помощи репеллентного, парализующего и антифидантного действия.

Препараты имеют достаточно длительный эффект последействия даже в условиях прямого солнечного освещения. Защитное действие длится около 15 дней.

При соблюдении всех рекомендаций по применению препараты на основе эсфенвалерата безопасны для пчел, занимающихся медосбором. Эсфенвалерат малотоксичен для теплокровных и человека. Высокотоксичен для рыб.

Эсфенвалерат гидролитически устойчив. При попадании в водоем сохраняется в воде до 10 суток, при этом испарение не будет играть особой роли в его исчезновении. Лабораторные исследования показывают, что эсфенвалерат является весьма токсичным для водных организмов [14].

. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили, ракообразные Dapnia magna, выращиваемая в климатостате «В-4» по ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06. Т 16.1:2.3:3.9-06.

Для культивирования дафний использовалась биологизированная вода из аквариума, кормом служили зеленые водоросли (хлорелла). Культура выращивалась при температуре 21±1 оС и освещенности 400-600 лк при продолжительности светового дня 12 часов.

В данной работе регистрация траектории движения дафний осуществлялась при помощи программно-аппаратного комплекса «ТrackTox», реализующего алгоритмы компьютерного зрени. Для измерения дафний использовался бинокулярный микроскоп «Биомед-5» с окулярным микрометром. Обработка и анализ получаемых данных производился при помощи специализированной программы.

Рис.3. Схема определения траектории движения дафний при помощи прибора «ТrackTox»

Единичная дафния при помощи микропипетки быстро и аккуратно переносятся из маточной культуры в прозрачную пластиковую тестовую камеру с 25 мл культивационной воды, далее камера переносится в анализатор токсичности, расположенный в термостатируемых условиях (20±2 °C). Дафнии выдерживаются 2-3 мин. в камере для акклиматизации, после чего в течение последующих 30 мин. производится измерение плавательной активности, т.н. «контроль». Дафния переносится в другой контейнер с уже подготовленным раствором токсиканта. После 2-3 минут экспозиции, в течение 15 мин. снова производится измерение плавательной активности, т.н. «опыт». В ходе всего эксперимента, данные визуализируются на экране, а в конце эксперимента данные по плавательной активности дафнии передаются в текстовый файл, доступный для последующей обработки и статистического анализа.

Фрактальный характер движения дафний устанавливали с помощью метода подсчета клеток. Для этого определяли количество пересечений клеток разного масштаба траекторией дафнии. На основании этих данных строили график, в случае его линейности делали вывод о фрактальном характере движения.

Приближенную фрактальную размерность траектории движения дафний устанавливали по формуле:

FD= log (N)/ [log (N) +log (D/L)],

где L - это общая длина плавательной траектории, D - это диаметр описанной траектории, N - количество сегментов.

Различия между выборками устанавливали при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни. Статистическую обработку данных выполняли в программе Statistica 10.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего было произведено 10 измерений плавательной активности Dapnia magna с использованием прибора «ТrackTox»: 5 контрольных проб и 5 с добавлением пестицида эсфенвалерат в концентрации 0,3 мкг/л.

С помощью метода подсчета клеток (box-counting method) было установлено, что траектория плавания дафний действительно имеет фрактальный характер. Этот метод представлен на рисунке 4. Здесь мы видим пример траектории движения дафнии (t = 60 c) и количество пересекаемых клеток в зависимости от масштаба сетки.

Рис.4. Применение метода подсчета клеток для оценивания фрактальной размерности траектории движения дафний

По найденным параметрам построили уравнение регрессии (рис. 5): Х - количество клеток на стороне сетки, ВС - количество пересеченных клеток. Фрактальная размерность траектории дафнии для этого же времени, рассчитанная по формуле составила 1,38.

:

Рис.5. Применение метода подсчета клеток для оценивания фрактальной размерности траектории движения дафний

Рис.6. Рассчитанные фрактальные размерности (FD) траекторий плавания дафний в сериях «контроль-опыт»

На рисунке 6 мы видим рассчитанные фрактальные размерности траекторий плавания дафний в сериях «контроль-опыт»: di-k - фрактальная размерность траектории i-ой дафнии в контроле (t = 30 мин.); di-tx - фрактальная размерность траектории i-ой дафнии в опыте с эсфенвалератом (t = 30 мин.). Звездочкой обозначены значимые отличия по U-критерию Манна-Уитни (P < 0,05).

Рис.7. Сводные рассчитанные фрактальные размерности траекторий плавания дафний: в контроле (control; N = 5) и в опыте с пестицидом эсфенвалератом (esfenvalerate; N = 5)