Прежде чем проводить эксперименты по биотестированию, нужно вырастить культуру тест-организмов.
Последовательно далее рассмотрим особенности выращивания культур тест-организмов и проверки их пригодности для использования в биотестировании.
3.1 Биотестирование на ракообразных
Методика предназначена для определения острой токсичности природной и сточной воды, сбрасываемой в водоемы.
Принципы культивирования рачков Daphnia magna Straus и Ceriodaphnia affinis Lilljeborg
Период созревания Daphnia magna до вымета молоди при оптимальной температуре и хорошем питании занимает 5-10 суток. Продолжительность жизни 110-150 суток, при температурах свыше 25 °С она может сокращаться до 25 суток.
Рис.3.1. Строение Daphnia magna
При оптимальных условиях содержания партеногенетические поколения следуют одно за другим каждые 3-4 суток. У молодых дафний число яиц в кладке 10-15, затем оно возрастает до 30-40 и более, снижаясь до 3-8 и до 0 за 2-3 суток до смерти.
Культуру дафний выращивают в термостатируемом при 18-22 °С люминостате (освещенность 400-600 люкс, продолжительность светового дня 12-14 часов). Опыты по биотестированию вод желательно проводить в том же люминостате.
Для получения исходного материала для биотестирования 30-40 самок с выводковыми камерами, полными яиц или зародышей, за 1 сутки до биотестирования пересаживают в емкости объемом 0,5-2 л. После появления молоди их отделяют от взрослых особей с помощью капроновых сит с разным диаметром пор.
Принципы культивирования цериодафний аналогичны описанным для дафний. Следует помнить, что цериодафнии более требовательны к содержанию кислорода в воде (не менее 5 мг/л), оптимальная температура культивирования 23-27°С. Период созревания рачков от рождения до момента вымета молоди короче, чем у дафний - от 4 до 5 суток.
При биотестировании важно учитывать следующие моменты:
- Молодь рачков в 4-5 раз более чувствительна к действию токсикантов, чем взрослые особи.
- Кормление рачков во время острого опыта уменьшает токсичность примерно в 4 раза.
- В мягкой воде токсичность веществ повышается. Ионы магния обычно уменьшают токсичность солей, ионы кальция - снижают токсичность.
- Присутствие комплексообразующих веществ (гуминовые кислоты, аминокислоты и т.п.) увеличивает накопление токсикантов, но снижает их токсичность.
- Дефицит кислорода в воде ускоряет накопление токсических веществ в водной среде.
- Солнечный свет увеличивает токсичность в основном за счет возрастания количества свободных радикалов.
Определение устойчивости Daphnia Magna Straus к бихромату калия
Прежде всего необходимо оценить пригодность лабораторной культуры дафний для последующего биотестирования вод. Эталонным токсикантом служит бихромат калия.
Стакан емкостью 100-250 мл (21 штука).
Пипетки мерные на 1, 10, 25 мл 2-го класса точности (по 1 штуке). Колба для разбавляющей (контрольной) воды (РВ) емкостью 3 л. Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), на 250 мл (1 шт.), на 500 мл (2 шт.), на 1000 мл (1 шт.).
210 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.
Приготовить 100 мл 0,1% раствора К2Сr2О7 (1000 мг/л).
Для этого 0,1 г просушенного К2Сr2О7 растворить в 100 мл дистиллированной воды.
Расставить 21 стакан с надписями по следующей схеме:
К1 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л
К2 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л
КЗ 0,25 мг/л 0,5 мг/л 0,75 мг/л 1 мг/л 2 мг/л 3 мг/л
Посадка рачков
Во все стаканы с растворами посадить по 10 рачков в возрасте строго 4-24 часа. Посадку производить с помощью микропипеток со съемными пластиковыми наконечниками. Концы наконечников предварительно необходимо обрезать под величину дафнии одно-двухдневки.
Эксперимент
Подсчет выживших рачков производят визуально через 24 часа. Во время опыта рачков не кормят. Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%. Результаты заносят в протокол опыта.
Определение токсичности сточной (природной) воды на Daphnia magna.
Материалы.
Стаканы емкостью 150-250 мл (8-16 штук).
Колба для разбавляющей (контрольной) воды емкостью 3 л.
Мерные колбы на 100 мл (1 шт.), 1 л (1 шт.).
Мерный цилиндр или мерный стакан на 150-200 мл.
От 40 до 80 рачков в возрасте 4-24 часа. Разница в возрасте особей не должна превышать 4 часов.
Подготовка опыта.
Расставить 16 стаканов с надписями по следующей схеме:
К1 Ст.вода б/р N 1 Ст.вода 1:10 N 5 Ст.вода 1:100 N 9
К2 Ст.вода б/р N 2 Ст.вода 1:10 N 6 Ст.вода 1:100 N 10
КЗ Ст.вода б/р N 3 Ст.вода 1:10 N 7 Ст.вода 1:100 N 11
К4 Ст.вода б/р N 4 Ст.вода 1:10 N 8 Ст.вода 1:100 N 12
Разлить по стаканам контрольную (разбавляющая вода) и испытуемую воду (ст.вода) по 150 мл на стакан:
К1-К4 - 600 мл разбавляющей воды (РВ),
Ст.вода б/р (без разбавления) - 600 мл (4 х 150 мл).
Ст.вода 1:10 - 100 мл Ст.воды б/р + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:10.
Ст.вода 1:100 - 100 мл Ст.воды 1:10 + 900 мл РВ = 1 л Ст.вода 1:100
Стаканы с растворами расставить в люминостате.
В обязательном порядке скорректировать рН проб до 6,5-8,5 с помощью растворов NaOH или НСl, если они не соответствуют указанным выше нормативам.
Насыщенность тестируемых проб кислородом также должна лежать в указанных рамках.
Посадка рачков.
Во все стаканы посадить по 5 рачков в возрасте строго 4-24 часа.
Эксперимент.
Подсчет погибших рачков производят визуально через 1, 6, 24, 48, 72, 96 часов (окончание определения острой токсичности). Смертность рачков в контроле не должна превышать 10%.
Результаты заносят в протокол опыта.
Биотестирование прекращают, если в любой период времени в опыте гибнет 50% и более особей.
Если А >= 50%, то тестируемая вода (опыт) остротоксична.
Если А < 50%, то тестируемая вода не оказывает острого токсического действия.
Для более точного определения острой токсичности строят график, где по оси абсцисс (ось X) откладывают время в часах, а по оси ординат (ось Y) смертность в процентах к контролю (А). Из графика находят ЛТ50 - время, в течении которого погибает 50% дафний.
3.2 Биотестирование с использованием водорослей
Методика предназначена для определения токсичности природных и сточных вод.
Общие принципы культивирования микроводорослей
Эффективное культивирование одноклеточных зеленых водорослей в лаборатории определяется в основном наличием минеральных элементов в питательной среде, достаточно интенсивным освещением (2000-3000 люкс) и определенной температурой (18-20 °С).
Лучшей средой для выращивания зеленых водорослей для токсикологических является питательная среда Успенского N 1, которая содержит более низкую общую концентрацию солей.
Все манипуляции со средой Успенского N 1 при работе с водорослью Scenedesmus проводятся при строгом соблюдении условий стерильности.
Недопустимым является совместное культивирование данной водоросли с хлореллой в одном люминостате (хлорелла быстро засоряет и подавляет культуру сценедесмус).
Продолжительность опытов по выявлению токсичности вод может быть 4, 7, 14 и более дней в зависимости от поставленных задач. Максимальное накопление токсиканта в клетках водорослей отмечается, обычно, к исходу 3-4 суток, поэтому чаще всего определение острой токсичности ограничивают 4 сутками.
Рис. 3.2. Водоросли Scenedesmus quadricauda.
Если в результате биотестирования на острую токсичность выявлена достоверная стимуляция роста водорослей, то для окончательного суждения о токсичности пробы необходимо ставить хронический эксперимент (до 14 суток).
Достоверная стимуляция роста водорослей свидетельствует о наличии эвтрофирующего загрязнения, а достоверное угнетение роста водорослей - о наличии токсического загрязнения.
Подготовка культуры.
В опыте использовать 5-10 суточную культуру, находящуюся в экспоненциальной фазе роста.
Перед посевом культуру сгущают одним из трех способов: - отстаиванием 2-3 дня, центрифугированием, фильтрованием через мембранный фильтр N 4 или фильтровальную бумагу с синей лентой. Полученная суспензия (концентрат) клеток используется для последующего посева.
Посев.
Производится в большую опытную колбу емкостью 1,5 л, в случае биотестирования в колбах (по 100 мл) или в колбу емкостью 150 мл при биотестировании в пенициллиновых пузырьках (по 10 мл). Обычно требуется примерно 30 мкл суспензии на 30 мл воды.
Рис. 3.3. Посев культуры.
В опытных колбах после посева должно быть около 200-300 тысяч клеток водорослей в 1 мл (не более 500 тысяч/мл) - едва заметное зеленоватое окрашивание на белом фоне.
Разлив.
Из большой колбы произвести разлив культуры по колбам (3 повторности по 100 мл) или пенициллиновым пузырькам (3 повторности по 10 мл).
Оценка результатов опыта по определению устойчивости культуры к бихромату калия.
Подсчет производят с помощью микроскопа (например, типа "Биолам") при 80-100 кратном увеличении.
Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или Фукс-Розенталя. Камеру и относящееся к ней покровное стекло обезжиривают, покровным стеклом накрывают камеру и притирают его до образования радужных колец интерференции. Из каждой колбы пипеткой наносят по одной капле тщательно перемешанной суспензии на верхний и нижний края покровного стекла. Камеру заполняют так, чтобы не образовывались пузырьки воздуха, избыток суспензии вытесняется по канавкам. Просматривают 16 квадратов по диагонали или все поле камеры в случае малой численности водорослей (при одном заполнении камеры просчитывают не менее 50 клеток).
Из каждой колбы просматривают не менее трех проб.
Оценка токсического действия химического соединения или тестируемой воды делается на основании достоверности различий между показателями численности клеток водорослей в контроле и в опыте.
При этом вычисляют:
а) средние арифметические величины численности клеток - Xi и X (из двух и шести подсчетов, соответственно).
б) численность клеток в процентах от контроля. Сумма (X - Xi)
в) среднее квадратичное отклонение (б):
,
где
n - количество повторностей; в данном случае n = 3;
в) ошибку среднего арифметического (X): ;
г) Td - критерий достоверности различий двух сравниваемых величин:
,
где
xk и xо - сравниваемые средние величины (в контроле и опыте),
Sk - So - квадраты ошибок средних в контроле и опыте.
Td рассчитывают на каждые сутки и сравнивают с табличной величиной Tst - стандартным значением критерия Стьюдента.
Принимают уровень значимости Р = 0,05 и степень свободы (n1 + n2 - 2), т.е. (3 + 3 - 2) = 4.
Tst при степени свободы 4 равно 2,78.
Если Td больше или равно Tst, то различие между контролем и опытом достоверно - тестируемая вода загрязнена (токсическое или эвтрофирующее загрязнение)
Если Td меньше Tst, то различие между контролем и опытом не достоверно - тестируемая вода не загрязнена.
Для расчетов Td можно использовать калькуляторы типа МК-51 и МК-71, а также компьютерные электронные таблицы (например, программу "Сигма" ЦСИАК), что значительно ускоряет работу.
Для графического представления результатов биотестирования по оси абсцисс откладывают время в сутках, а по оси ординат либо число клеток водорослей в 1 мл, либо число клеток водорослей в процентах от контроля.
Определение устойчивости Scenedesmus quadricauda к действию бихромата калия.
Добавить последовательно в 30 мл дистиллированной воды (контроль) 30 мкл KNO3, 30 мкл MgSO4, 30 мкл Ca(NO3)2, 30 мкл КН2РО4, 30 мкл К2СО3.
Хронический опыт (в пузырьках).
На 7-е сутки биотестирования проводят смену контрольной и тестируемой воды в стерильных условиях. При этом в новую партию пузырьков наливают по 7,5 мл контрольной и тестируемой воды. Затем в пузырьки добавляют по 0,01 мл (10 мкл) каждого из 5 маточных растворов солей и по 2,5 мл старой культуры из пузырьков, в которых проводилось биотестирование в остром опыте. Подсчет численности клеток проводят на 7-е, 10-е и 14-е сутки.
На практике бывает удобно использовать таблицу оценки результатов биотестирования по 5-бальной шкале.
Необходимо помнить, что увеличение биомассы водорослей может быть связано с наличием эвтрофирующих загрязнений в испытуемой воде, в этом случае о наличии токсического эффекта можно судить после испытания на нескольких тест-объектах.
3.3 Биотестирование на инфузориях
В основу метода положен один из вариантов определения острой токсичности воды по выживаемости инфузорий Paramecium caudatum.
Используется:
- для определения токсичности сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения, что позволяет проводить технологическую корректировку режима подготовки и очистки сточных вод;
- для определения токсичности локальных потоков сточных вод, что позволяет выяснять их взаимодействие, определять вклад каждого потока в токсичность сточных вод отдельного предприятия, суммарную токсичность сточных вод, поступающих на биологические очистные сооружения;