- для определения токсичности водных растворов отдельных веществ и их смеси.
Принцип методики.
Методика определения острой летальной токсичности сточной воды по выживаемости инфузорий основана на установлении количества погибших или обездвиженных особей после экспозиции в тестируемой воде. Критерием острой летальной токсичности является гибель или обездвиживание 50% и более особей в течение 1 часа в тестируемой воде по сравнению с их исходным количеством.
Тестовый организм.
В качестве тест-объекта используют лабораторную монокультуру Paramecium caudatum Ehrenberg.
Paramecium caudatum - одноклеточные организмы размером 180-300 мкм. Тело сигарообразной или веретенообразной формы, покрытое плотной оболочкой (пелликулой).
Paramecium caudatum - массовый вид в пресной воде с высоким содержанием органических веществ. В сточной воде является часто основным видом, поли-альфа-мезосапроб. Простейшие, в том числе ресничные инфузории, составляют основную часть микрофауны активного ила. Они участвуют в освобождении очищаемой воды от взвешенных бактериальных клеток и от рыхлых, плохо оседающих бактериальных агломератов, способствуя тем самым повышению эффективности очистки.
Выделение и культивирование.
Выделение из активного ила. Наиболее подвижную и крупную особь отлавливают из пробы активного ила очистных сооружений и переносят в микроаквариум со стерильной водопроводной водой.
Путем последовательного переноса этой особи из лунки в лунку добиваются отделения ее от других простейших и цист. Затем помещают отмытую инфузорию в пробирку со средой культивирования.
Через 7-8 суток из полученной таким образом монокультуры одну наиболее крупную и подвижную особь вновь переносят в свежую среду.
Спустя 8-10 суток культуру можно использовать для определения токсичности. биологический тестирование природный токсичность
Культивирование инфузорий на молоке. Культуру парамеций выращивают на дехлорированной водопроводной воде, которую добавляют разбавленное в 20 раз такой же водой пастеризованное молоко. Пересевают культуру инфузорий один раз в месяц (при необходимости один раз в три недели).
Материалы и оборудование.
Подсчет Paramecium caudatum производят с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9, МБС-10 или иного, обеспечивающего 8-24 кратное увеличение. Для разбавления и внесения одинакового количества исследуемой пробы используют стандартные стеклянные пипетки.
Биотестирование проб воды проводят не позднее 6 часов после их отбора, при невозможности проведения анализа в указанный срок пробы воды охлаждают (+4°С).
Не допускается консервирование проб с помощью химических консервантов.
В качестве контрольной используют водопроводную воду, которую дехлорируют путем отстаивания и аэрирования с помощью микрокомпрессора в течение 7 суток.
Для определения токсичности отдельных веществ или их смеси из них готовят растворы путем добавления определенных количеств маточного раствора, исследуемого(ых) вещества(в) в водопроводную дехлорированную воду. Маточные растворы готовят на дистиллированной воде.
При проведении биотестирования температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре культуры.
При наличии в пробе крупнодисперсных взвесей необходима фильтрация.
При проведении биотестирования значения рН тестируемых растворов должно находиться в интервале от 6,5 до 7,6.
Биотестирование проводят в помещении, не содержащем вредных паров и газов, при рассеянном свете и температуре воздуха 18-28°С.
Проведение биотестирования.
Для биотестирования неразбавленной сточной воды или ее разбавлений, а также растворов отдельных токсических веществ (смеси веществ) используют микроаквариум с лунками, который помещают на предметный столик стереомикроскопа.
Рис. 3.4. Культура инфузорий.
Одну из лунок заполняют культурой инфузорий с помощью капиллярной пипетки.
В свободные лунки капиллярной пипеткой рассаживают по 10-12 особей в каждую лунку, так чтобы на одну пробу тестируемой воды приходилось не менее 30 инфузорий в трех лунках (трехкратная повторность).
При посадке тест-объекта количество культуральной жидкости в лунке не должно превышать 0,02 мл.
Три лунки используют в качестве контрольных.
После посадки инфузорий наливают в контрольные лунки по 0,3 мл дехлорированной водопроводной воды, в опытные - по 0,3 мл пробы тестируемой воды. Отмечают время начала биотестирования и подсчитывают под микроскопом количество особей в каждой лунке.
Микроаквариум с заполненными лунками помещают в чашку Петри, на дно которой кладут фильтровальную бумагу, смоченную водой, чтобы не испарялось содержимое лунок, и выдерживают в течение 1 часа при температуре 22-24°С. По истечении этого времени производят подсчет выживших особей под микроскопом. Выжившими считаются инфузории, которые свободно перемещаются в толще воды. Обездвиженных особей относят к погибшим. Результаты подсчета записывают в рабочий журнал.
Результаты биотестирования считаются правильными и учитываются, если гибель инфузорий в контрольных лунках не превышала 10%.
После подсчета особей в каждой из трех лунок находят среднее арифметическое количество инфузорий, выживших в тестируемой воде.
Тестируемую воду оценивают как оказывающую острое летальное действие, если в течение 1 ч в ней гибнет 50% и более инфузорий.
При определении острой летальной токсичности разбавлений пробы сточной воды или водного раствора отдельного вещества (смеси) устанавливают среднюю летальную кратность разбавлений (среднюю летальную концентрацию), вызывающую гибель 50% тест-объектов в течение 1 часа - ЛКр50 - 1 ч (ЛК50 - 1 ч).
Для построения графика с целью расчета ЛКр50 - 1 ч (ЛК50 - 1 ч) тест-параметр выражают в условных единицах - пробитах, а кратность разбавления (концентрацию) - в логарифмических величинах.
На оси абсцисс откладывают логарифмы концентраций кратности разбавлений сточной воды (концентраций вещества), на оси ординат величины тест-параметра в пробитах. Полученные точки соединяют прямой.
Из точки на оси ординат, соответствующей 50% гибели тест-объекта, проводят линию, параллельную оси абсцисс до пересечения с линией графика.
Из точки их пересечения опускают перпендикуляр на ось абсцисс и находят логарифмы ЛКР50 - 1 ч.
Величину найденного логарифма переводят в величину кратности разбавления (концентрацию, выраженную в мг/л вещества).
Результаты биотестирования представляют в виде протокола.
После проведения биотестирования микроаквариумы промывают водой (температура не выше 40°С), протирают ваткой, смоченной в спирте, промывают дистиллированной водой.
Оценка токсичности воды с использованием биотеста на водорослях.
По формуле рассчитаем коэффициент прироста численности водорослей за 96 ч (4 сут).
M= [m/(nV)]103,
где
M - численность клеток водорослей, тыс.кл./мл;
m - число подсчитанных клеток;
n - число просчитанных маленьких квадратов камеры;
V - объем части камеры, соответствующей площади маленького квадрата, мл.[3]
3.4 Оценка токсичности воды с использованием экспресс-биотеста на коловратках
Для определения возможного острого токсического действия исследуемой воды проводим экспрессное биотестирование на массовой культуре коловраток.
Для оценки токсического действия исследуемой воды используем средние данные о СОС (показатель скорости осветления среды).
биотестирование вода токсичность калий
СОС =[(C0 - Ct)/(C0Nt)]V,
где
СОС - показатель скорости осветления среды, мкл/(экз.. мин);
C0 и Ct - число клеток водорослей в одном большом квадрате камеры Горяева в начале и конце биотестирования соответственно;
N - число коловраток в микроаквариуме;
t - время биотестирования, мин;
V - объем воды в микроакварему, мкл.[2]
4. Опыт практического использования биотестирования (биомониторинга) в ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга»
Системы биомониторинга качества воды есть на всех водопроводных станциях города и ближайших пригородов. Их главная задача - следить за уровнем токсичности источника питьевого водоснабжения Санкт-Петербурга - невской воды.
В ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга» для проведения биомониторинга используются раки (невские и австралийские) и улитки. Это - животные-биоиндикаторы. Системы биомониторинга, применяемые в Водоканале, разработаны учеными Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра экологической безопасности Российской академии наук.
Состояние воды в Неве контролируют речные раки.
Раки применяются для биомониторинга на Водоканале с декабря 2005 года. Этот вид биомониторинга используется на всех водозаборных сооружениях города.
На Юго-Западных очистных сооружениях контролируют качество очистки сточных вод также при помощи раков: в зимнее время года - это речные раки, а летом - австралийские (более теплолюбивые).
А следить за составом дымовых газов, выходящих с завода по сжиганию осадка на Юго-Западных очистных сооружениях, помогают улитки.
Все животные-биоиндикаторы не подменяют собой методы приборного и лабораторного контроля, а дополняют их. [13]
4.1 Биотестирование природных вод на Невском раке
Вода из Невы, прежде чем попасть на очистные сооружения и стать водопроводной, контролируется, помимо лабораторий, при помощи Невских раков.
Технологам необходимо знать, не поступает ли на очистные сооружения вода, загрязненная такими токсическими веществами и в таких концентрациях, которые не могут быть удалены из воды с помощью имеющихся технологий и оборудования.
Существующие физико-химические методы анализа по экономическим причинам могут обеспечивать контроль только ограниченного числа загрязняющих воду веществ и требуют времени, а технологам важно получить сигнал о поступлении на водозабор подобной воды как можно раньше.
Оперативно, в реальном времени, получить информацию об опасности можно только при использовании методов биомониторинга живыми водными организмами, в частности, раки, которые очень чувствительны к загрязнениям среды их обитания.
Процесс биомониторинга.
К панцирю рака, сидящего в аквариуме, приклеивается волоконно-оптический датчик, который позволяет незаметно для животного в течение длительного времени регистрировать его сердцебиение. На экран компьютера диспетчера смены непрерывно выводятся уже обработанные результаты показателей сердечного ритма и стресс-индекса раков в виде системы «светофор»: красный, желтый или зеленый световые сигналы.
Нормальный сердечный ритм ничем не обеспокоенного рака (соответствующий зеленому сигналу), колеблется, в зависимости от температуры воды от 30 до 60 ударов в минуту, а стресс-индекс обычно близок к нулю. В случае опасности частота сердечных сокращений резко повышается не менее чем на 50%, а стресс-индекс возрастает до нескольких тысяч.
Рис. 4.1. Узкопалый речной рак Astacus leptodactylus.
При попадании в воду токсичных веществ раки реагируют в течение 1,5-2 минут (это время с учетом обработки данных). Их кардиоритм учащается, приборы дают сигнал тревоги (красный сигнал на мониторе диспетчера смены), по которому автоматически отбираются пробы воды для последующего подробного лабораторного анализа воды химическими и биологическими методами, и оповещаются все службы водопроводной станции.
Особые требования
Раки реагируют и на раздражители, не связанные с загрязнением воды - например на шум включаемого оборудования. Чтобы отсечь ложные срабатывания системы, ученые создали специальную аналитическую станцию, которая измеряет ряд характеристик воды - щелочность, температуру, мутность, а также снабжена датчиками шума и вибрации. Если аппаратура зарегистрирует вибрацию, то сигнал опасности в диспетчерскую не поступит, потому что датчики фиксируют момент, когда учащение сердцебиения рака совпадает с шумовым эффектом, и отсекают его, как не связанного с токсикологической опасностью.
Раки достаточно хорошо изученные животные с точки зрения физиологии и токсикологии. Однако для того, чтобы попасть в состав группы мониторинга, раки проходят тщательное биохимическое и физиологическое обследование здоровья. Работают только самцы в возрасте 3-5 лет, три дня через шесть. Срок их службы составляет примерно год. Дело в том, что по своей физиологии раки должны зимовать, впадая в этот холодный период в состояние «спячки», а лишение их того, что придумано природой, естественно, ослабляет животное. А к дежурству допускаются только здоровые особи в хорошем функциональном состоянии.
В конце 2010 года система биомониторинга с использованием раков была усовершенствована. Если раньше на рабочую смену приходилось по два рака, то теперь их - шесть. Однако модернизация системы биомониторинга заключается не только в количественных изменениях. С момента запуска биомониторинга у ученых из Санкт-Петербургского научно-исследовательского центра экологической безопасности РАН появились новые разработки. И в 2010 году эти разработки Водоканал внедрил на водопроводных станциях. Модернизация системы биомониторинга включает новые алгоритмы обработки сигналов. Все это вместе - более совершенная система обработки данных, увеличение числа дежурящих раков - повышает надежность биомониторинга, дает новые возможности для оперативного управления системой водоподготовки.