МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра генетики
Курсовая работа
ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ПРОДУКТИВНОСТЬЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Щуцкой Т.А.
Минск 2016
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Гормон роста и пролактин: структура и биологическая роль
1.2 Общие свойства
1.3 Понятие о ДНК-полиморфизме и МАS -селекции
1.4 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена bPit-1 с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота
1.5 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена гормона роста(bGH) c признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота
1.6 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена рецептора гормона роста (GH R) с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Выделение ДНК из цельной крови
2.2 Условия проведения ПЦР
2.3 Анализ генетического полиморфизма генов bPit-1-HinFI, bGH- Alul и bGHR-Sspl
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАННИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Результаты генотипирования и оценка соответствия наблюдаемых частот генотипов теоретически ожидаемым по закону Харди-Вайнберга
3.2 Сравнительный анализ распределения частот аллелей полиморфных генов соматотропинового каскада у представителей и аулиекольской и белоголовой пород
3.3 Обсуждение полученных результатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Пролактин (PRL) и гормон роста (GH) представляют собой семейство белковых гормонов, которые принимают участие в инициации и поддержании лактации у млекопитающих и могут рассматриваться как потенциальные генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота (КРС). Применение ДНК - маркеров для ускорения решения селекционных задач получило название “селекция с помощью маркеров или маркер -ассоциированная селекция (MAS - marker assisted selection)”. ДНК - маркеры - это аллельные варианты генов, напрямую или косвенно связанные с продуктивными и адаптационными признаками животных, с устойчивостью или восприимчивостью к заболеваниям. Выявление предпочтительных с точки зрения селекции вариантов таких генов позволяет дополнительно к традиционному отбору животных, например, по содержанию жира в молоке, по уровню удоя, проводить селекцию по генотипу.
К настоящему времени исследован рестрикционный полиморфизм в экзоне 3 гена bPRL с использованием рестриктазы Rsal, обусловленный транзицией A-G в кодоне для 103 аминокислоты и полиморфизм в 5 'нетранслируемой области, который был рассмотрен микросателлитным анализом [35].
Для селекции крупного рогатого скота мясного направления наибольший интерес представляет ген соматотропина (гормон роста - важнейший регулятор роста у млекопитающих) и гены, вовлеченные в работу всего гормонального цикла соматотропинового каскада. К ним относятся ген, принимающие участие в регуляции экспрессии гена соматотропина (такие как ген гипофизарного фактора роста-1 bPit-1) и опосредовании его физиологических эффектов на клетки-мишени (такие как ген рецептора гормона роста bGHR).
Достаточно простым способом применения физиологических эффектов соматотропина в мясном скотоводстве является его введение в рацион животных мясных продуктов. Это приводит к возникновению ряда серьезных заболеваний у человека, в том числе рак простаты [3-4]. Поэтому наиболее безопасным и эффективным способом интенсификации селекционного процесса остается поиск аллельных вариантов генов соматотропинового каскада, ассоциированных с повышенной мясной продуктивностью и применение их в ходе селекционного процесса [5].
Соматотропин, как и другие гены, отвечающие за развитие количественных признаков, является полиморфным. У крупного рогатого скота разных пород выявлен широкий набор их аллелей, представляющих интерес для MAS-селекции в качестве генетических маркеров хозяйственно полезных признаков. Имеется много данных о том, что некоторые его аллели ассоциированы с повышенным потенциалом мясной и молочной продуктивности у КРС [6-7]. Однако в ряде случаев, опубликованные данные об ассоциации аллелей генов соматотропинового каскада (bPit-1, bGH и bGHR) с признаками продуктивности, полученные на разных породах, трудно сопоставимы и противоречат друг другу [2,6,8,9,10], а для значительной части выявленных аллелей такие исследования не проводились.
Целью данной работы было изучение частоты полиморфных вариантов генов соматотропинового каскада bPit-1-HinFI, bGH-AluI и bGHR-Sspl, для оценки перспектив использования их в качестве генетических маркеров мясной продуктивности КРС.
Задачи:
1. Провести генотипирование быков - производителей аулиекольской и белоголовой пород по полиморфным вариантам генов, связанных с мясной продуктивностью (bPit-1-HinFI, bGH -Alul и bGHR - Sspl).
2. Провести оценку частот встречаемости аллельных вариантов у представителей каждой породы.
3. Провести сравнительный межпородный анализ распределения частот аллелей полиморфных генов соматотропинового каскада у представителей аулиекольской и белоголовой пород.
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Гормон роста и пролактин: структура и биологическая роль
Биологическая роль гормона роста
Соматотропин относится к группе анаболических гормонов. При введении его в организм животного с гипофизарной недостаточностью наблюдается усиление роста скелетных костей и других тканей, усиливается синтез белка и секреция молока. Проявление физиологического эффекта соматотропина связано с появлением в крови особых белков, которые называются соматомединами - веществами, опосредующими действие СТГ. Основным местом синтеза соматомединов является печень. Поэтому печень можно отнести к периферической эндокринной железе, секретирующей вторичные гормоны ( в частности соматомедины ) в ответ на действие продукта центральной железы - гипофиза .
Гормон роста образуется из прогормона с молекулярной массой 28кД, не обладающего гормональной активностью.
Регуляция синтеза и секреции гормона роста осуществляется множеством факторов. Основной стимулирующий эффект оказывает соматолиберин, основной тормозящий - гипоталамический соматостатин ( рисунок 1.1) [34].
Рисунок1.1-Регуляция синтеза и секреции гормона роста
Рецепторы гормона роста находятся в плазматической мембране клеток печени, жировой ткани, яичка , желтом теле, скелетных мышцах, хрящевой ткани, мозге, легких, поджелудочной железе, кишечнике, сердце, почках , лимфоцитах [34].
Основное действие гормона роста направлено на регуляцию обмена белков и процессов, связанных с ростом и развитием организма. Под влиянием гормона роста усиливаются транспорт аминокислот в клетке мышц, синтез белка в костях, хрящах, мышцах, печени и других внутренних органах, увеличивается общее количество РНК, ДНК и общее число клеток ( рисунок 1.2).
Рисунок 1.2- Влияние гормона роста на внутренние органы и ткани
Влияние гормона роста на рост скелета и мягких тканей требует участия веществ, которые синтезируются в ответ на взаимодействие гормона роста с рецепторами плазматической мембраны клеток различных тканей, в основном печени, и носят название соматомединов. Поскольку эти молекулы отличаются высокой гомологичностью друг к другу, а также к проинсулину, и обладает инсулиноподобной активностью и мощным ростостимулирующим действием, они называются инсулиноподобными факторами роста (ИФР-1- одноцепочечный полипептид, основного характера, содержащий 70 аминокислотных остатков, а полипептид ИФР-2 носит кислотный характер и состоит из 67 аминокислотных остатков). В крови примерно 95% соматомединов циркулирует в комплексе с белками. Синтез ИФР-1 в большей степени зависит от концентрации гормона роста в крови , чем синтез ИФР-2. В то же время ИФР-1, образующийся в печени, ингибирует синтез и секрециюгормона роста по механизму ретроингибирования, действуя на уровне гипофиза и гипоталамуса ( рисунок 1.3) [34].
Рисунок 1.3-Механизм действия гормона роста
Биологическая роль пролактина
В аденогипофизе образуется белковый гормон, близкий по химическим и биологическим свойствам соматотропину, - пролактин, или лактогенный гормон. Он значительно эффективнее стимулирует лактацию, чем соматотропин, и помимо этого обладает широким спектром биологического действия. Пролактин влияет на рост органов и тканей животных, регулирует водный и солевой баланс, стимулирует развитие вторичных половых признаков, индуцирует синтез а-лактальбумина и казеина, активирует синтез фосфолипидов [36]. Активирование транскрипции генов белков молока включает олигомеризацию рецептора и активацию киназы Jak2, которая фосфорилирует остатки тирозина у рецепторов сигнальных трансдукторов и активаторов транскрипции Stat5a и Sta5b . Сигнальные трансдукторы и активаторы транскрипции представляют собой семейство из 7 транскрипционных факторов. Stat5 также известны как главные медиаторы действия гормона роста и пролактина на гены, находящиеся под их контролем [35].
Рецепторы пролактина присутствуют в клетках многих тканей: в печени, почках, надпочечниках, яичках, яичниках, матке и других тканях.
Секрецию пролактина стимулируют тиролиберин, серотонин, окситоцин, ацетилхолин, ингибирующий эффект оказывает дофамин [34].
Структура генов пролактина и гормона роста
Молекула пролактина представляет собой одну полипептидную цепь, построенную из 199 аминокислотных остатков и имеющую три дисульфидные связи. Установлена первичная структура пролактина у человека и нескольких видов животных. Видовые различия в химическом строении пролактина немногочисленны. N-концевое положение в полипептидной цепи пролактина у человека и ряда животных (например свинья, кит ) занимает остаток лейцина. У других животных (например, овца, КРС) - остаток треонина. С-концевым аминокислотным остатком в молекуле пролактина независимо от видовой принадлежности является остаток цистеина. Молекула пролактина обладает довольно устойчивой третичной структурой; около 50% полипептидной цепи находится в виде а-спирали (рисунок 1.4) [36].
Рисунок 1.4 - Структура пролактина
Молекула соматотропина представляет собой одну полипептидную цепь, состоящую из 190-191 аминокислотных остатков. Соматотропины разной видовой принадлежности, обладая большими или меньшими различиями в аминокислотной последовательности, проявляют четкую структурную гомологию друг с другом. Все они содержат один остаток триптофана и 4 остатка цистеина. Последние образуют в молекуле два дисульфидных мостика, которые формируют две петли - большую, включающий центральный участок аминокислотной последовательности (в соматотропине человека между цистеином -54 и цистеином -165), и малую (на С-концевом участке между цистеином-182 и цистеином-189 ) (рисунок 1.5) [36].
Рисунок 1.5 - Структура соматотропина
1.2 Общие свойства
По структуре и биологическим свойствам пролактин имеет общие черты с гипофизарным гормоном роста и наряду с плацентарным лактогеном и пролиферином образует отдельное семейство - семейство пролактинподобных белков. Все эти гормоны состоят из одной негликозилированной полипептидной цепи и характеризуются значительным сходством первичной структуры.
Гормоны данного семейства, имея определенное структурное сходство, обладают и общностью ряда биологических свойств: все они проявляют в той или иной степени ростовую, анаболическую, гипергликемическую, липолитическую и лактогенную активности.
Поэтому гены пролактина и соматотропина, участвующие в одной метаболической системе, а именно в формировании молочной и мясной продуктивности, более адекватно отражают существующие ассоциации с параметрами молочной и мясной продуктивности КРС [37].
1.3 Понятие о ДНК-полиморфизме и МАS -селекции
Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, что обуславливает разнообразие признаков внутри вида. Различия между аллелями одного и того же гена, как правило заключается в незначительных вариациях его генетического кода. Большинство известных полиморфизмов выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома: экзонах, интронах, регуляторных участках и т.д.
Локус называется полиморфным, если в популяции существует два или более аллеля этого локуса. Однако, если один из аллелей имеет очень высокую частоту, скажем, 0,99 или больше, то высока вероятность того, что ни один другой аллель не будет присутствовать в выборке, взятой из популяции, если эта выборка не будет очень большой. Таким образом, обычно локус определяется как полиморфный, если частота наиболее распространенного аллеля меньше 0,99. Такое деление носит весьма условный характер .
Полиморфизм ДНК - это различия в чередовании нуклеотидов которые наблюдаются у различных особей одного вида.
ДНК - технологии широко используются для разработки методов селекции с помощью молекулярно-генетических маркеров - MAS, то есть маркирования главных генов количественных признаков QTL; сохранения биоразнообразия с использованием молекулярно-генетических маркеров, разработки генетически обоснованных программ разведения и подбора родительских пар животных, изучения генетических механизмов развития и предупреждения различных заболеваний [40].