Курсовая работа: Изучение полиморфных вариантов генов, ассоциированных с продуктивностью крупного рогатого скота

1.4 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена bPit-1 с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

Наиболее исследованным из полиморфных вариантов гена bPit-1 является bPit-1-HinFI полиморфизм, впервые описанный J.Woollard,1994, и впоследствии идентифицированный как молчащая G>A замена в области шестого экзона [11]. В работе R. Renaville, 1997г. Данная мутация исследована на голштино-фризской породе. Редкий аллель, характеризуемый отсутствием сайта рестрикции для фермента Hinf обозначен как А-аллель гена bPit-1-HinFI. Наиболее частый аллель, разрезаемый рестриктазой Hinf, обозначен как В-аллель . Было выявлено, что аллель А ассоциирован с более высокими показателями по признакам мясной продуктивности. Ассоциация данного полиморфизма с признаками мясной продуктивности исследована и другими авторами. Так, R.Renaville, 1997 г. у бельгийского голубого скота [12], определил генотип bPit-1-HinFI?? , как более редкий в исследуемой популяции. По его данным телята с генотипом bPit-1-HinFI?? обладали более высоким весом тела в возрасте 7 месяцев по сравнению с телятами носителями генотипов bPit-1-HinFI?? и bPit-1-HinFI?? , в то время как в возрасте 13 месяцев по показателю веса тела, предпочтительным оказался генотип bPit-1-HinFI??, Zwierzchowski, 2002г. При изучении мясных пород польского скота, также выявил положительную ассоциацию со скоростью роста в ранний период постнатального развития у телят носителей аллеля A гена bPit-1-HinFI [7]. Однако данные об ассоциации аллеля B гена bPit-1-HinFI с весом телят в раннем возрасте, полученные Renaville в исследованной популяции пьемонтского скота подтверждения не получили [12].

Кроме того, группой ученых университета штата Огайо США под руководством проф. М. Дэвиса проведен ряд исследованний ассоциации других полиморфных вариантов гена bPit-1 с признаками мясной продуктивности у представителей ангусского скота [13-14]. Ими было обнаружено три полиморфизма в области интрона 3. Однако, ни для одного из исследованных полиморфизмов не было выявлено значительной ассоциации ни со скоростью роста, ни с параметрами туши [15].

1.5 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена гормона роста(bGH) c признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

Учитывая значительную роль в процессе роста и лактации, bGH ген является потенциальным объектом для изучения ассоциации его молекулярных вариантов с признаками продуктивности крупного рогатого скота.

С помощью метода ПЦР-ПДРФ, используя рестрикционный фермент Alul, Lucy et.al., 1993, выявил два аллеля, отвечающих за две альтернативные формы бычьего соматотропина с остатком лейцина или валина в положении 127 [16-17]. В большинстве исследований животные с генотипом VV ( две копии гена с валином в положении 127) демонстрировали более низкие темпы роста, чем животные с генотипом LV и LL. Они также обладали более низкими показателями веса, ежедневного прироста веса и др. [18]. Имеются также данные о том, что по этим признакам преимущественным является генотип LV . В работах Zwerzchowski et al. [12,19] было показано, что VV мясные быки имели более высокий суточный прирост веса по сравнению с быками обладавшими другими генотипами. С другой стороны, Di Stasio et.al., изучая Piedmontese cattle, показал отсутствие связи между полиморфизмом bGH гена с признаками мясной продуктивности. И имеющиеся на данный момент данные позволяют предположить, что фенотипические эффекты гена bGH на рост и мясные количественные признаки отличны между собой.

1.6 Исследования ассоциации полиморфных вариантов гена рецептора гормона роста (GH R) с признаками мясной продуктивности крупного рогатого скота

В 1999 году Aggrey et al. при изучении голштинских быков было выявлено три полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) с использованием рестриктаз Alul, Stul и Accl. Ассоциация данных полиморфизмов с признаками продуктивности изучалась впоследствии различными учеными.

В работах A.Maj относительно bGHR-Alul полиморфизма, [21] при изучении ассоциации полиморфизма bGHR-Alul с признаками мясной продуктивности у животных польской черно-пестрой породы, показано, что животные носители аллеля bGHR- Alul (-) обладали более высокими показателями по таким параметрам, как вес тела и масса вырезки. При этом наибольшие результаты по этим признакам были характерны для животных с генотипом bGHR-Alul(-/-).

Новый полиморфизм был обнаружен A. Maj и соавт. в положении - 1104 5'фланкирующей области и представляет собой транзицию С>Т [21]. При исследовании данного полиморфизма на представителях молочной породы, польской черно-пестрой, не было выявлено ассоциации ни с признаками мясной, ни с признаками молочной продуктивности [23].

В 1999 году Ge. W. И соавт. при исследовании популяции ангусского скота была обнаружена одиночная нуклеотидная замена (SNP) в области промоторной зоны первого экзона [24]. Maj A. исследовал данный полиморфизм на мясных породах, таких как ангусский скот, лимузинский и герефорды .Ген RFLP-Nsil оказался ассоциированным с ежедневным поглощением корма. Генотип (-/-) или (+ /-) гена RFLP-Nsil был ассоциирован с меньшим потреблением корма, а также у животных с генотипом Nsil -/- был более высокий показатель процента постной вырезки по сравнению с другими генотипами [21].

Замена Т>А в экзоне 8 вызывает неконсервативную замену нейтрального фенилаланина на незаряженный, но полярный остаток тирозина (F279Y) . Соответствующий остаток фенилаланина локализован в трансмембранном домене гена рецептора гормона роста и является консервативным для всех изученных млекопитающих. Blott выявила значительную ассоциацию Phe/Tyr полиморфизма в трансмембранном домене с большей молочной продуктивностью и составом молока [25] у животных немецкой и новозеландской популяции голштинских коров. В дальнейшем мутация F279Y была исследована Luca Fontantasi и соавт., 2007 на животных итальянской голштино-фризской породы, итальянской черной, итальянской симментальской, джерсейской пород. Была отмечена довольно высокая частота предпочтительного Y -аллеля у представителей итальянских популяций исследованных пород [26].

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Выделение ДНК из цельной крови

Должны выполняться общие требования, предписанные для взятия биологического материала и его транспортировки:

1.Цельная кровь должна быть охлаждена, но не заморожена

2.Если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована в ближайшие 48 часов, биологический образец должен быть заморожен до температуры от - 20 до - 80єС, либо криозаморозка

3.Повторение циклов замораживания-оттаивания не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК

4.Пробирки с антикоагулянтами, такими как ЭДТА, необходимо перемешать, что бы не допустить свертывания образца , но не встряхивать

Методы выделения ДНК:

1.Метод экстракции с помощью органических растворителей

2.Метод экстракции с помощью силики (диоксид кремния)

3.Метод экстракции с помощью гельфильтрации

4.Метод экстракции с помощью магнитных частиц

5.Метод экстракции с помощью микроцентрифужных колонок

6.Ионообменная смола

7.Метод экстракции на бумажных фильтрах [39]

2.2 Условия проведения ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты

1.ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать

2.Праймеры - короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18-30 оснований комплиментарные противоположным концам х цепей требуемого фрагмента ДНК

3.Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu -полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

4.Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

5.Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. гормон дезоксирибонуклеиновый аллель ген

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96 С° на 0,502 мин. Для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество не специфичные продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижает, чтобы праймеров могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4-5 градусов ниже их температуры плавления. Время стадии - 0,5 - 2 мин.

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймеры в качестве затравки. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq, Pfu наиболее активны при 72 . Эта стадия длиться 7-10 мин(рисунок 1.5) [38].

Рисунок 2.1 - Стадии ПЦР

Таблица 1 - Условия проведения ПЦР

2.3 Анализ генетического полиморфизма генов bPit-1-HinFI, bGH- Alul и bGHR-Sspl

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов включал обработку амплификата сайт-специфической рестриктазой и последующее разделение полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bPit-1 в экзоне 6 проводился с помощью рестриктазы HinFI . Полиморфизм обусловлен A>G нуклеотидной заменой, не приводящей к измененнию аминокислотной последовательности. Сайтом узнавания для рестриктазы HinFI является последовательность GvANTC . Разрезаемый в ходе ферментации фрагмент содержит нуклеотид А соответствующий аллелю bPit-1-HinFI? [11]. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bPit-1-HinFI?.

Длина амплифицируемого фрагмента гена bPit-1 составляет 451 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 244 и 207 п.н. На электрофореграмме визуализируются варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 451 п.н. ( генотип bPit-1-HinFI??); две полосы 244 и 206 п.н.( генотип bPit -1-HinFI??); три полосы - 451 , 244 и 207 п.н. ( генотип bPit-1-HinFI??) (рисунок 2.1).

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовптельности гена bGH в экзоне 5 проводился с помощью рестриктазы Alul. Полиморфизм обусловлен транзицией С>G, приводящей к замене аминокислоты лейцин на валин в последовательности белка. Сайтом узнавания для рестриктазы Alul является последовательность AGvCT . Распознаваемый ферментом аллель содержит нуклеотид С и обозначен как bGH-AlulL [27]. В случае присутствия G нуклеотида сайт рестрикции исчезает, такой аллель обозначен как bGH-AlulV (рисунок 2.2).

Длина амплифицируемого фрагмента гена bGH составляет 208 п.н. Длина фрагментов после рестрикции составляет 172 и 35 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипо : одна полоса 208 п.н.( генотип bGH-Alul ??); две полосы 172 и 35 п.н. (генотип bGH-Alul??); три полосы 208, 172 и 35 п.н.( генотип bGH-Alul??). Фрагмент рестрикции 35 п.н. на агарозном геле не визуализируется.

Анализ полиморфизма нуклеотидной последовательности гена bGHR в экзоне 8 проводился с помощью рестриктазы Sspl. Рестриктаза Sspl распознает Т>А транзицию в экзоне 8. Длина SNP вызывает подстановку полярного, хотя и незаряженного остатка тирозина вместо нейтрального фенилаланина в положении 279 белка . Сайтом узнавания для рестриктазы является последовательность ААТvАТТ . Разрезаемый ферментом амплификат содержит нуклеотид Т соответствующий аллелю bGHR-. В случае присутствия А -нуклеотида сайт рестрикции исчезает , такой аллуль обозначен как bGHR-. Длина амплифицируемого фрагмента гена bGHR составляет 182 п.н. Длина фрагментов после рестрикции 158 и 24 п.н.

На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины , характерные для генотипов : одна полоса 184 п.н. (генотип bGHR-) ; две полосы 158 и 24 п.н.( генотип bGHR-); три полосы - 182 , 158 и 24 п.н. (генотип bGHR-). Фрагмент 24 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 2.3).

Генотип животного по всем анализируемым генам документируется и заносится в общую базу данных.

Сравнение выборок по распределению частот аллелей исследуемых генов, а также оценку соответствия фактического распределения генотипов теоретически ожидаемому по закону Харди-Вайнберга , проводили с помощью критерия чІ. Различия во всех случаях рассматривались как статистически достоверные при уровне значимости Р?0,05.