Статья: Коррекция биологических свойств бифидобактерий, выделенных от ВИЧ-инфицированных детей

Коррекция биологических свойств бифидобактерий, выделенных от ВИЧ-инфицированных детей

Захарова Ю.В., Леванова Л.А., Сухих А.С.; ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Резюме

Цель. Изучение in vitro влияния веществ с антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, а также лизоцима на биологические свойства бифидофлоры от ВИЧ-положительных пациентов.

Материалы и методы. Исследовали гидрофобность, аутоаггрегацию, специфическую адгезию у 15 штаммов бифидобактерий от ВИЧ-инфицированных детей после воздействия этилметилгидроксипиридина сукцината и лизоцима. Гидрофобность изучали по Rosenberg et al. (1980) с модификациями L-Q Wang et al. (2010); аутоаггрегацию - по Del Re et al. (2000); специфическую адгезию - по Брилису (1986). Содержание жирных кислот в клеточных стенках определяли с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Достоверность различий определяли с помощью непараметрических критериев оценки достоверности. Различия считали значимыми при p<0,05.

Результаты. При добавлении этилметилгидроксипиридина сукцината в питательную среду к культурам, имеющим низкую антиоксидантную активность, происходит увеличение в 10 раз количественного уровня бифидобактерий по сравнению с контролем. Также этилметилгидроксипиридина сукцинат увеличивает в 2 раза гидрофобность клеточной поверхности за счет стимуляции синтеза ненасыщенных жирных кислот. Увеличивается в 4 раза способность штаммов к аутоаггрегации, но снижается специфическая адгезия. Нивелировать данный эффект позволяет совместное использование этилметилгидроксипиридина сукцината и лизоцима. Использование лизоцима позволяет повысить специфическую адгезию штаммов не более чем на 9,1%.

Заключение. Использование этилметилгидроксипиридина сукцината позволяет модулировать поверхностные свойства бифидобактерий, что влияет на показатели неспецифической адгезии и на скорость размножения популяции. Таким образом, научно обосновано включение в схемы коррекции кишечной микрофлоры у ВИЧ-инфицированных пациентов антиоксидантов, мембранопротекторов и лизоцима.

Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, бифидобактерии, антиоксиданты, лизоцим, гидрофобность, аутоаггрегация.

Abstract

Correction of biological properties of bifidobacteria isolated from HIV-infected children

Yulia V. Zakharova, Lyudmila F. Levanova, Andrey S. Sukhikh; Kemerovo State Medical University

Aim. To investigate the influence of ethylmeth- ylhydroxypyridine succinate and lysozyme on in vitro biological properties of bifidoflora isolated from HIV-positive patients.

Materials and Methods. We investigated hydrophobicity, autoaggregation, and specific adhesion of 15 bifidobacteria strains from HIV-infected children after exposure to ethylmethylhydroxypyr- idine succinate, lysozyme, or both combined. Hy- drophobicity was studied according to the Rosenberg method (1980) modified by Wang (2010); autoaggregation was documented as by Del Re (2000); specific adhesion was measured in accordance with Brilis (1986). The content of fatty acids in cell walls was determined using gas chromatography-mass spectrometry.

Results. Addition of ethylmethylhydroxypyridine succinate to the cultures with low antioxidant activity led to the 10-fold increase in the number of Bifidobacteria, 4-fold increase in autoaggregation, and 2-fold increase in hydrophobicity by stimulating the synthesis of unsaturated fatty acids, as compared to the control culture. Combination of ethylmethylhydroxypyridine succinate with lysozyme elevated specific adhesion of Bifidobacteria up to 9.1%.

Conclusions. The use of ethylmethylhydroxypyridine succinate allows to control surface properties of Bifidobacteria affecting their growth and non-specific adhesion. This may indicate usefulness of ethylmethylhydroxypyridine succinate and lysozyme for the correction of gut microbiota in HIV-infected patients.

Keywords: HIV-infection, Bifidobacteria, antioxidants, lysozyme, hydrophobicity, autoaggregation.

Введение

Нарушения кишечного микробиоценоза при ВИЧ-инфекции регистрируют на всех стадиях заболевания [1, 2]. Изменениям архитектоники кишечной микрофлоры способствуют репликация вируса в эпителиоцитах, а также иммунные расстройства [3]. Как было показано ранее, распространенность и характер микроэколо- гических нарушений кишечника у ВИЧ-инфицированных детей не отличаются от аналогичных показателей у детей без ВИЧ-статуса [4]. Наблюдается снижение количества бифидобактерий, лактобацилл, происходит увеличение содержания условно-патогенных микросимбионтов, которые нередко являются причиной оппортунистических инфекций у ВИЧ-инфицированных пациентов.

При этом установлено, что изменяются биологические свойства бифидофлоры, которая играет ключевое значение в поддержании ми- кроэкологического равновесия в сложном микробном сообществе кишечника. У популяции бифидобактерий от ВИЧ-инфицированных детей снижается антиоксидантная активность, ги- дрофобность клеточной поверхности, страдает специфическая адгезия [5]. Изменения жирнокислотного состава клеточных стенок, которые формируются под воздействием липаз условно-патогенной микрофлоры, сказываются на скорости размножения и ростовых свойствах бифидофлоры. В связи с этим у ВИЧ-инфицированных детей наблюдается снижение количественного уровня бифидобактерий и устраняется доминирующий и регулирующий компонент их воздействия на весь кишечный микробиоценоз.

Таким образом, восстановление только количественного уровня бифидобактерий при коррекции кишечного микробиоценоза у ВИЧ-инфицированных пациентов будет недостаточным для стабилизации кишечного микробиоценоза. Необходимо корректировать и биологические свойства бактерий. Первоочередными точками приложения внешнего модулирующего воздействия на бифидобактерии при ВИЧ-инфекции являются антиоксидантная система и поверхностные свойства бактериальной клетки.

Цель исследования: изучение in vitro влияния веществ с антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, а также лизоцима на биологические свойства бифидофлоры от ВИЧ-положительных пациентов.

Материалы и методы

Оценивали влияние этилметилгидроксипиридина сукцината и лизоцима на биологические свойства 15 штаммов бифидобактерий (по 5 штаммов B.breve, B.bifidum, B.longum), выделенных от ВИЧ-инфицированных детей. Изоляцию бифидобактерий проводили стандартным бактериологическим методом с использованием анаэробной технологии и селективных питательных сред. Верификация на родовом уровне включала определение наличия специфического фермента бифидобактерий фруктозо-6-фосфат фосфокетолазы (Ф-6-ФФК). Для этого микроорганизмы, выращенные на MRS Broth (Hi-Media, Индия) промывали дважды 50 мМ фосфатным буфером (рН 6,5). Клетки разрушали ультразвуком на холоду и добавляли по 0,25 мл раствора фторида натрия, Na йодацетата и фруктозо-6-фосфата (НС соли: 70% чистоты).

Реакцию останавливали добавлением 1,5 мл гидроксиламина солянокислого, 1 мл смеси трихлоруксусной кислоты и 4 М HCl. Далее добавляли 1 мл цвет-индикаторного агента (раствор FeCl₃6H₂O 5% (м/о)). Пробирка без фруктозо-6-фосфата служила в качестве контроля для упрощения визуального сравнения. При образовании из фруктозо-6-фосфата ацетил-фосфата формировался гидроксамат хелат железа с красновато-фиолетовой окраской, что является показателем наличия Ф-6-ФФК. Идентификацию бифидобактерий до вида проводили по биохимическим свойствам с помощью коммерческой тест-системы АНАЭРО-test 23 (Lachema diagnostica s.r.o., Чехия).

Специфическую адгезию штаммов изучали по В.И. Брилису (1986) на модели эритроцитов I (0) группы. Вычисляли индекс адгезии микроорганизмов (ИАМ), при этом адгезию считали низкой при ИАМ=1,76-2,5 ед; средней - при ИАМ=2,51-4,0 ед; высокой - при ИАМ >4,0 ед. Гидрофобность определяли по Rosenberg et al. (1980) c модификациями L-Q Wang et al. (2010) как процент гидрофобности (Н%). Штаммы считали высокогидрофобными при Н = 60% и > среднегидрофобными - при Н = 4059%, низкогидрофобными - при Н< 39%. Изучение аутоаггрегации (А%) бифидобактерий проводили по Del Re et al. (2000). Культуры относили к низкоаггрегативным при А (%) < 10, к среднеаггрегативным - при А (%) 10-40, к высокоаггрегативным - при А (%) > 40. Определение антиоксидантных свойств бифидобактерий проводили согласно [6]. Антиоксидантную активность выражали в единицах антиоксидантной активности - Е. Жирнокислотный состав бактериальных фосфолипидов определяли с помощью газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) как было описано ранее [7].

В качестве инструментов для коррекции поверхностных и антиоксидантных свойств бифидобактерий использовали 2% раствор этилметилгидроксипиридина сукцината - торговое название «Мексидол». Фармакологическая группа: антиоксидант. Производитель: «Фармасофт» НПК ООО, Россия. Также использовали лизоцим, который является действующим веществом препарата «Лизобакт». Фармакологическая группа: антисептик комбинированного состава. Производитель: «Босналек» АО, Босния и Герцеговина.

Данные представлены в виде абсолютных величин. В связи с тем, что распределение данных было не по нормальному закону, для статистической обработки применяли непараметрические критерии оценки статистической значимости. Распределения количественных признаков для парных данных описывали с помощью медианы (Ме) и интерквартильной широты. Данные представлены в виде Ме (LQ; UQ). Сравнение проводили с помощью критерия знаков Уилкоксона. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты

В процессе жизнедеятельности в биологических системах разного уровня сложности могут образовываться свободные радикалы, которые обладают высокой реакционной способностью. Активные кислородные метаболиты используются представителями нормальной микрофлоры как средства конкурентной борьбы в микробиоценозах, кроме того, их синтезируют клетки иммунной системы. Независимо от происхождения свободные радикалы повреждают белки, нуклеиновые кислоты и липиды, входящие в состав клеток микроорганизмов и организма человека.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что дисбактериоз кишечника, независимо от его природы, сопровождается увеличением содержания в кишечнике токсических форм кислорода [8], в том числе и у ВИЧ-инфицированных пациентов. Бифидобактерии по типу дыхания являются анаэробными бактериями, некоторые виды и штаммы аэротолерантны. У них функционируют ферментные антиоксидантные системы - НАДН-оксидаза, НАДН-пероксидаза, а некоторые виды бифидофлоры продуцируют каталазу. Кроме того, антиоксидантные свойства данных бактерий связывают с жирнокислотным составом клеточной стенки. Однако не всегда антиоксидантные системы бифидобактерий «выдерживают» высокую концентрацию токсических форм кислорода, поэтому снижается популяционный уровень данных микросимбионтов.

Установлено, что внесение этилметилгидроксипиридина сукцината в питательную среду не влияет на количественный уровень B.bifidum и B.longum, так как содержание бифидобактерий до и после внесения антиоксиданта не изменилось и составило 5 и 6 КОЕ/мл соответственно. При этом количественный уровень B.breve увеличивается в 10 раз по сравнению с контролем, т.е. с 5 до 6 КОЕ/мл. Дело в том, что у штаммов B.breve антиоксидантная активность составила 0,3 (0,1; 0,5) Е_аоа. У B.bifidum и В.1опдит данные показатели были в 2-3 раза выше и составили 0,7 (0,2; 1,0) Е_аоа и 1,1 (0,6; 1,4) Е_аоа соответственно. Введение в питательную среду этилметилгидроксипиридина сукцината значительно снижает воздействие токсических форм кислорода на бифидобактерии со слабыми антиоксидантными свойствами и создает оптимальные условия для размножения их популяции.

Добавление в питательную среду этилметилгидроксипиридина сукцината изменяет также поверхностные свойства бактериальных клеток, так как препарат обладает мембранопротекторным действием. Так, установлено, что под влиянием препарата у B.bifidum в 1,8 раза, а у B.breve более чем 2 раза увеличивается гидрофобность клеточной поверхности (таблица 1).

Таблица 1. Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината на биологические свойства и содержание жирных кислот у бифидобактерий. Me (Щ; UQ)

При этом у изначально высокогидрофобных штаммов В.1опдит показатели текучести мембраны практически не изменяются.

Увеличение гидрофобности бактериальной поверхности у B.breve сопровождается ростом в 4 раза аутоаггрегации штаммов. Опять же введение препарата не изменяет аутоаггрегации у В.1опдит и B.bifidum, которые характеризовались изначально высокими показателями признака, т.е. можно говорить об избирательности действия этилметилгидроксипиридина сукцината, которая определяется начальными свойствами штаммов. В основе изменения поверхностных свойств бифидобактерий лежит увеличение массы жирных кислот в клеточной стенке за счет роста массы ненасыщенных жирных кислот (таблица 1). Если учесть, что ненасыщенные жирные кислоты проявляют антиоксидантные свойства, то применение этил- метилгидроксипиридина сукцината приведет к модуляции не только кристаллического состояния бактериальной мембраны, но и антиоксидантных возможностей бактерий.