Автореферат: Липидный спектр сыворотки крови и полиморфизм генов-кандидатов дислипидемии в пожилом и старческом возрасте

Концентрацию ХС ЛПНП рассчитывали по формуле: ХС ЛПНП = ОХС - ХС ЛПВП - ТГ/2,2 [Friedewald WT et al, 1972]; прогностический коэффициент атерогенности - по формуле: КА = (ОХС - ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1980].

Для оценки уровня ОХС, ХС ЛПНП, ХС ЛПВП и ТГ принимали во внимание возрастные критерии, предложенные в Национальной образовательной программе по холестерину (National Cholesterol Education Program, 2001). Для констатации ДЛП, кроме концентрации основных липидных компонентов, учитывали результаты теста на наличие хиломикронов (внешний вид сыворотки после отстаивания при температуре +4 ^оС в течение 16-20 часов) и результаты электрофореза сыворотки крови в полиакриамидном геле с окраской судановым черным [Климов А. Н., Никульчева Н.Г., 1999; Томпсон Г.Р., 1991]. Фенотипирование ДЛП проводили по классификации, предложенной Fredrickson D.S. et al. (1967), одобренной и расширенной Всемирной Организацией Здравоохранения (1970).

Для генотипирования по полиморфным ДНК-локусам использовали образцы ДНК, полученные методом фенольно-хлороформной экстракции из 8 мл цельной венозной крови [Sambrook J. et al., 1989]. В качестве генетических маркеров в работе анализировались полиморфные варианты генов АРОЕ (R158C, C112R, экзон 4), PON1 (Q192R, экзон 6), CETP (I450V, экзон 14). Анализ полиморфизма генов осуществляли с помощью методов полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. ПЦР проводили на аппарате “Терцик” (ДНК-технология, Россия). Олигонуклеотидные праймеры синтезировались в фирме “Синтол”, эндонуклеазы и ДНК-полимераза Thermus aquaticus (Taq-полимераза) были получены в фирме “Бион” (Москва). Разделение фрагментов ДНК проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном или агарозном гелях. После окончания электрофореза гели окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали распределение в них фрагментов ДНК с использованием системы гель-видеодокументации (“Vilber-Lormat”, Франция).

Статистическая обработка полученных данных выполнена с использованием пакета программ Statistica for Windows 5.0 (StatSoft). Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали критерий ч² (Р), определяемый с помощью программы RxC по алгоритму, описанному D. Roff и P. Bentzen (1989). Доверительные интервалы частот аллелей и генотипов рассчитывали на основе точной формулы с использованием F-распределения [Животовский Л.А., 1984]. Относительный риск ДЛП по аллелю или генотипу вычисляли как отношение шансов OR [Bland J., Altman D., 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Липидный спектр сыворотки крови в разных возрастных группах

Результаты исследования показали, что даже в этнически однородной выборке, сформированной из сельских жителей, концентрации липидных компонентов в сыворотке крови и величины КА сильно варьируют, часто выходя за границы референтных величин. У значительной части лиц, участвовавших в исследовании, были выявлены ДЛП. Поэтому при нормолипидемии (НЛП) особенности липидного спектра в разных возрастных группах оценивали по содержанию липидных компонентов (табл. 2), а при наличии ДЛП - по частотам разных фенотипов ДЛП (табл. 3).

На рис. 1 отображены возрастные особенности анализируемых показателей в группах обследованных лиц с НЛП. Как видно из рисунка, концентрации ОХС, ХС ЛПНП, ТГ и величина КА изменяются с возрастом, содержание же ХС ЛПВП не претерпевает существенных изменений в широком возрастном диапазоне.

В возрасте 21-29 лет по сравнению с младшей возрастной группой концентрации ОХС, ХС ЛПНП, ТГ и величина КА были достоверно повышены (Р<0,001). Статистически значимых различий концентрации липидов и величины КА между группами среднего (40-49, 50-55 лет) и пожилого возраста (56-74 лет) не прослеживается (табл. 2); в то же время значения анализируемых показателей в них более высоки относительно других возрастных групп.

В старческом возрасте концентрации ТГ, ОХС и ХС ЛПНП были существенно ниже, чем в среднем и пожилом, но оставались более высокими по сравнению с младшей возрастной группой. В целом, как следует из рис. 1, возрастная динамика концентраций ОХС, ХС ЛПНП, ТГ, величины КА имеет характер параболической кривой: как у мужчин, так и у женщин, начиная с младшего возраста, происходит их постепенное нарастание, выход на плато в среднем и пожилом возрасте, и понижение - в старческом возрасте.

Согласно результатам дисперсионного анализа влияния пола на сывороточную концентрацию липидов и величину КА, достоверных гендерных

Таблица 2. Возрастные значения концентрации липидных компонентов в сыворотке крови и значений КА при нормолипидемии

Примечание: концентрация липидов -- в ммоль/л, возраст - в годах.

Индексами указаны группы, с которыми различия по величине показателя статистически значимы (р<0,05).

Рисунок 1. Возрастная динамика сывороточной концентрации липидных компонентов и КА в группах с НЛП по гендерному признаку.

Обозначения: ВП - величина показателя (концентрация липидов - в ммоль/л, КА - в относительных единицах). Возрастные группы обследованных: 1-я - младшая (14-20 лет), 2-6 - средний возрастной период (2-я - 21-29 лет, 3-я - 30-39 лет, 4-я - 40-49 лет, 5-я - 50-55 лет), 6-я - пожилая (56-74 года), 7-я - группа старческого возраста (75-85 лет), 8-я - долгожители (старше 85 лет). различий концентрации ОХС и ТГ не наблюдалось.

Вместе с тем концентрация ХС ЛПНП у мужчин в возрасте 30-39 лет была достоверно выше, чем у женщин; в 21-29 лет и в 40-49 лет у женщин содержание ХС ЛПВП было достоверно более высоким (р=0,002 и 0,015), а значение КА - более низким (р=0,006 и 0,033) по сравнению с мужчинами того же возраста. Однако в более старшей возрастной группе (50-59 лет) и в пожилом возрасте (от 56 до 74 лет) различий такого рода не прослеживалось.

У значительной доли лиц во всех возрастных группах обнаруживались ДЛП (табл. 3). У таких пациентов содержание липидных фракций в сыворотке крови отличалось от аналогичных параметров у лиц с НЛП и имело гораздо больший разброс, что делало невозможным сравнение возрастных групп по концентрации липидов. В связи с этим сравнение групп проводилось только по частоте встречаемости различных фенотипов ДЛП. В младшей возрастной группе (14-20 лет) ДЛП были выявлены в 45 % случаев; преимущественный фенотип составляла гипо--ЛП-емия. Приведенные данные, на первый взгляд, парадоксальны, но они сопоставимы с результатами других исследований (г. Архангельск - Лебедев А.В. и др., 2006; г. Москва - Прохорович Е.А., 1999). В младшей возрастной группе, основную часть которой составляли юноши приписного и призывного возраста, высокая частота ДЛП может быть обусловлена нейроэндокринными перестройками в организме в период полового созревания, а также пубертатной гиперинсулинемией и физиологической инсулинорезистентностью. Известно, что ДЛП могут способствовать манифестации атерогенных изменений уже в раннем возрасте. Принимая во внимание полученные нами данные, можно предположить, что у лиц с ДЛП из младшей возрастной группы в дальнейшем может быть повышен риск развития ССЗ. В возрастных группах 21-30 лет и особенно 30-39 лет частота ДЛП была существенно ниже, чем у подростков. Ее минимум, по всей вероятности, соответствует установившемуся образу жизни и эффективному поддержанию гомеостаза организма. В дальнейшем, по мере увеличения возраста, частота ДЛП нарастает, в пожилом и старческом возрасте - значительно, но у долгожителей-женщин вновь несколько снижается, оставаясь все же большей, чем у лиц пожилого возраста. Возрастная динамика частот ДЛП у мужчин и у женщин в целом сходна (рис. 2), несколько различаясь в молодом возрасте и после 85 лет (у единственного в выборке мужчины-долгожителя была выявлена гипо--ЛП-емия).

Таблица 3. Частоты обнаружения дислипидемий в разных возрастных группах

Рисунок 2. Частоты дислипидемий по гендерному признаку (ДЛП-М и ДЛП-Ж) в разных возрастных группах: 1- младшая, 2, 3, 4, 5 - средняя (21-29, 30-39, 40-49 и 50-55 лет), 6 - пожилая, 7 - старческая возрастная группа, 8 - долгожители.

В младшей возрастной группе в основном обнаруживалась гипо--ЛП-емия (38,9 %). В других возрастных группах превалировали ГЛП IIa, IIb и та же гипо--ЛП-емия; прочие фенотипы обнаруживались менее чем в 5 % случаев. В пожилом и старческом возрасте, а также среди долгожителей наблюдалось существенное повышение доли лиц с изолированной гиперхолестеринемией (ГЛП IIа), что соответствует повышенному риску ССЗ.

Полиморфизм в экзоне 4 гена АРОЕ: ассоциации с возрастом и концентрацией липидов

В результате типирования по полиморфизму в экзоне 4 гена АРОЕ у этнических татар, проживающих в республике Башкортостан, были выявлены три аллеля и 6 генотипов. Частота аллеля АРОЕ*3 (78,74 %) существенно превышает частоты аллелей АРОЕ*2 (6,34 %) и АРОЕ*4 (14,92 %). Среди обследованных лиц 64,08 % являются носителями генотипа АРОЕ*3/*3 и 20,63 % - носителями генотипа АРОЕ*3/*4, а доли носителей генотипов АРОЕ*2/*2, АРОЕ*2/*3, АРОЕ*2/*4 и АРОЕ*4/*4 составляют 0,52 %, 8,69 %, 2,93 % и 3,14 % соответственно. Наблюдаемое распределение частот генотипов не отличается от теоретически ожидаемого равновесного распределения Харди-Вайнберга (І = 1,35, р = 0,865).

Статистический анализ результатов исследования показал, что в исследуемой популяции сцепленные полиморфные маркеры R158C и C112R в экзоне 4 гена АРОЕ ассоциированы с концентрацией липидов в крови (табл. 4).

В выборке лиц с НЛП сравнительно более высокие концентрации ТГ наблюдались у носителей генотипов АРОЕ*2/*2 (1,28 ммоль/л) и АРОЕ*4/*4 (1,47 ммоль/л), более низкие концентрации ХС ЛПВП - у носителей генотипа АРОЕ*2/*4 (1,09 ммоль/л), а более высокое содержание ОХС, ХС ЛПНП и величина КА - у лиц, гомо- и гетерозиготных по аллелю АРОЕ*4.

Обнаружено, что в выборке лиц с ДЛП по сравнению с группой лиц с НЛП повышены частоты генотипов АРОЕ*2/*4 (5,86 % против 1,33 %, ²=15,01, Р=0,0001) и АРОЕ*4/*4 (5,86 % против 1,66 %, ²=11,99, Р=0,0005), а также наблюдается тенденция к понижению частот генотипов АРОЕ*3/*3 (59,61 % против 65,89 %, ²=3,47, Р=0,063) и АРОЕ*2/*3 (6,84 % против 10,15 %, ²=2,71, Р=0,099). Среди лиц с ДЛП со сравнительно большой частотой обнаруживаются носители аллеля АРОЕ*4 (19,54 % против 12,48 % у лиц с НЛП, ²=16,03, Р=0,0001), с меньшей частотой - носители аллеля АРОЕ*3 (73,78% против 81,11% у лиц с НЛП, ²=13,02, Р=0,0003). Таким образом, шансы развития ДЛП повышены у носителей генотипов АРОЕ*2/*4 (OR = 4,62; CI: 1,98-10,74) и АРОЕ*4/*4 (OR = 3,68; CI: 1,68-8,08).

Таблица 4. Результаты дисперсионного анализа эффекта разнообразия генотипов и аллелей по полиморфизму в экзоне 4 гена АРОЕ на содержание липидов в сыворотке крови и величину КА