Контрольная работа
МЕТОДИЧЕСКИЙ ПОДХОД К МОНИТОРИНГУ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ
. Определение количественного состава микроорганизмов водных экосистем
Впервые микробиологические исследования морской воды в открытых участках Северного Ледовитого океана были проведены в 1899 году (Levin Dr., 1899). На основе полученных результатов был сделан вывод о том, что морские воды почти стерильны, а пресная вода при тех же географических условиях сильно обсеменена бактериями.
Исследования Исаченко Б.Л. опровергли представления Левина о бедности микробного населения вод Полярного бассейна и определили направления микробиологических исследований (Исаченко, 1914, 1937).
С появлением метода прямого счета бактерий, предложенного Разумовым (Разумов, 1932), оказалось возможным получить подробные сведения о численности и распределении бактериопланктона Баренцева моря. Метод считается наиболее точным при определении количественных соотношений отдельных групп микроорганизмов, что очень важно для расчета общей численности, биомассы и продукции бактериопланктона (Романенко, Кузнецов, 1974; Ягодка, 1975). Метод разливок, применяемый Исаченко Б.Л., имеет значительные погрешности (Родина, 1950, 1965, 1971).
Метод прямой микроскопии дает возможность определить численность всех клеток микроорганизмов, присутствующих в пробе воды (Разумов, 1962). С помощью этого метода исследователями показано, что численность бактерий в воде водоемов на 2-4 порядка выше той, которая получена посевами проб воды на твердые или жидкие питательные среды (Сорокин, 1971, 1973, 1975).
Изучение морфологического состава бактериопланктона показало, что в холодных северных водах Баренцева моря преобладают палочки, а в южных - кокковидные клетки (Буткевич, 1932, 1938, 1958).
В сезонном аспекте максимальное количество бактерий в прибрежной полосе Баренцева моря наблюдалось в осенние и весенние месяцы. На глубине 5-7 м были отмечены сезонные изменения количества бактерий, что свидетельствует об их участии в процессах превращения веществ в донных отложениях ниже поверхности (Лимберг, 1941).
Было установлено, что в северных морях из-за постоянно низких температур воды доминируют психрофильные формы сапрофитных бактерий, температурный оптимум роста которых лежит в пределах 0…10 °С (Лях, 1976). Численность сапрофитных бактерий, растущих на плотных питательных средах при 20 °С, летом 1976 года в южной части Баренцева моря составила 10 кл/мл воды (Пилипас, 1977). Интерес представляет также установленный факт высокой биохимической активности сапрофитных бактерий в условиях низких температур воды (Мишустина, 1981; Мишустина, Каменева, 1981; Мишустина, Батурина, 1984; Мишустина, Щеглова, Мицкевич, 1985; Теплинская, 1985, 1986; Мишустина, Байтаз, Москвина, 1997;).
Изучение численности и распределения сапрофитных бактерий в северных морях, в частности в Баренцевом, должно быть направлено на выявление, по крайней мере, двух экологических групп: психрофильных (холодолюбивых) и мезофильных (холодовыносливых) форм микроорганизмов, хотя провести четкую границу между ними не представляется возможным (Теплинская, 1985).
При исследовании морфологического состава микроорганизмов Баренцева моря, было установлено, что бактериопланктон открытых районов моря представлен палочками, кокками, коккобациллами и эллипсоидными клетками. В общем бактериопланктоне доминировали кокки, а самой малочисленной группой были эллипсоидные клетки (Байтаз, Байтаз, Мишустина, 1995, 1996).
При оценке процесса самоочищения в воде, почве, донных отложениях, процессов биологической очистки в различных сооружениях для обезвреживания сточных вод и, особенно в условиях химического загрязнения объектов окружающей среды, используется количественный подсчет сапрофитных микроорганизмов (Моисеенко, Яковлев, 1990; Безель, Кряжимский, Семериков и др., 1993; Моисеенко, 1998).
Для определения активности микроорганизмов в природных водах и в процессах естественного очищения среды предложены радионуклидные методы (Ильинский, Семененко, 1994; Коронелли и др., 1994).
Учет численности микроорганизмов дает возможность оценить санитарное состояние водного объекта, активность процессов самоочищения в местах загрязнения различными выбросами (Акимов, 1975; Ильинский, 2000).
Анализ литературных данных по исследованию количественного состава бактериопланктона показал, что в условиях Кольского Заполярья в водных экосистемах преобладают сапрофитные психрофильные бактерии.
микроорганизм водный кишечный фильтр
2. Определение качественного состава микроорганизмов водных экосистем
.1 Грамположительные неспорообразующие кокки
Из грамположительных неспорообразующих кокковых микроорганизмов наиболее распостранены в водных объектах бактерии родов Micrococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Sarcina (Дутова, Гофтарш, 1975).
Род Micrococcus
Бактерии рода Micrococcus галотолерантные, растут в присутствии 5 % NaCl. Оптимальная температура для роста 25…37 °С. Встречаются на поверхности гидробионтов, в воде, на коже млекопитающих и в почве, на пищевых продуктах и в воздухе (Дутова, Гофтарш и др., 1976; Определитель бактерий Берджи, 1997; Ильинский, 2000; Shewan, 1961; Cann, 1965).
Род Enterococcus
Микроорганизмы рода Enterococcus широко распространены в окружающей среде, особенно в фекалиях животных и человека. Энтерококки выдерживают низкие температуры, устойчивы к воздействию дезинфицирующих средств (Турчинский, 1970).
Дифференциация энтерококков по видам была разработана после исследований их антигенной структуры (Lancefield, 1933). Основные виды - Ent. faecalis, Ent. faecium, Ent. durans (Седов, 1971; Мюнх и др., 1985; Sherman, 1937; Heeschen, Tolle, Zeidler, 1967; Kalina, 1968).
В настоящее время используют различные методы определения энтерококков, применяя дифференциально-диагностические среды для выделения и количественного учета. Определение энтерококков проводят титрационным методом, основанным на посеве исследуемой воды или ее разведений в одну из сред накопления, с последующим высевом на подтверждающую среду (Корш, Артемова, 1978). Широко распространен метод с использованием щелочно-полимиксиновой среды (Калина, 1965; Калина, 1972). Интерес представляет и метод определения энтерококков, принятый по предложению специалистов в составе Унифицированных методов СЭВ (Унифицированные методы…, 1975; Heinrich, 1966). Метод мембранных фильтров для определения энтерококков применял Slanetz с соавторами (Slanetz, 1957). Для количественного определения энтерококков был предложен метод мембранных фильтров на плотной питательной среде (Турчинский, 1972). Заслуживают также внимания и ускоренные методы определения энтерококков в воде (Buck, 1969; Kalina, 1968; Mead, 1963).
По соотношению различных видов Enterococcus можно сделать заключение о происхождении фекального загрязнения (Ильин, Касторский, 1968). При оценке санитарного состояния Кольского залива отмечено, что в условиях Севера энтерококк сохраняет свое индикаторное значение, являясь более чувствительным показателем фекального загрязнения водоемов в холодное время года (Пономарева, 1978).
Учитывая вышесказанное, в условиях Кольского Заполярья количественное определение этого показателя в объектах окружающей среды приобретает особую актуальность. При этом важно соотношение группы кишечных палочек и энтерококков.
Род Staphylococcus
Бактерии рода Staphylococcus обитают в объектах окружающей среды, куда они попадают с кожных покровов и слизистых оболочек животных и человека. Их выделяют также из сырья и пищевых продуктов. Они могут присутствовать в составе микрофлоры воздуха и воды, хорошо сохраняется в присутствии поваренной соли в концентрации до 10 % (Тимаков, 1973; Билетова и др., 1980; Пяткин, 1981).
Среди бактерий рода Staphylococcus имеются патогенные и непатогенные виды. Непатогенные стафилококки являются нормальной микрофлорой кожи и зева теплокровных позвоночных и человека (Столмакова, 1959; Будагян, 1973). К разновидностям патогенного стафилококка относят St. аureus, впервые выделенный Розенбахом в 1842 году (Покровский и др., 1999).
Индикаторное значение может иметь как общее число стафилококков, определяемое по пигментообразованию, форме колоний, микроскопии, так и патогенные стафилококки, определяемые по указанным признакам (Нефедьева, 1955; Световидова, 1973; Перетрухина, Белокопытова, 1990).
Патогенные стафилококки служат показателем загрязнения воды микрофлорой верхних дыхательных путей и кожных покровов человека в процессе купания (Чистович, 1969; Muller, Stojew, 1971). Этот показатель рекомендуется определять в воде плавательных бассейнов (пресной и морской), в водоемах, используемых для рекреационных целей, в том числе в морях (Унифицированные методы, 1975).
Определение патогенного стафилококка является перспективным тестом для оценки загрязнения морской воды и гидробионтов (Перетрухина, 1999, 2001).
.2 Грамположительные спорообразующие палочки
К грамположительным спорообразующим палочковидным микроорганизмам относятся бактерии родов Bacillus и Clostridium, к кокковидным - Sporosarcina.
Род Clostridium
К санитарно-показательным клостридиям относятся Cl. perfringens (Уэлч, Нэталл, 1892; Вейон, Жубер, 1893) и Cl. botulinum (Зенгбуш, 1818; Ван Эрменген, 1869). С помощью этих показателей можно выявить давность фекального загрязнения водных объектов, определяя соотношение количества вегетативных и споровых форм этих бактерий (Билетова, 1980).
Спорообразующие анаэробные бактерии из рода Clostridium, в основном Cl. sporogenes (Мечников, 1908), Cl. perfringens и др., находятся в иле и гидробионтах (Глотова, 1936; Булатова, 1969; Калина, 1969; Валявская, 1973; Пяткин, 1981).
Из всех многочисленных патогенных и сапрофитных видов рода Clostridium наиболее частым и постоянным обитателем кишечника человека и животных является Cl. perfringens (Булатова, 1969; Калина, 1969; Тимаков, 1973; Перетрухина, Белокопытова, 1987; Перетрухина, Овчинникова, Завалко, 2000; Alderman, King, Sugijama, 1972).
В качестве санитарно-показательного микроба Cl. perfringens используют для контроля эффективности очистки сточных вод. Преимущество его перед кишечной палочкой состоит в том, что он не размножается в отстойниках (Сидоренко, 1968; Калина, Чистович, 1969; Лабинская, 1972; Артемова, 1973; Валявская, 1973; Герасименко, 1976; Пяткин, 1981; Мюнх и др., 1985; Перетрухина, 2000).
Cl. botulinum продуцирует ботулинический экзотоксин, вызывающий интоксикацию. Рыба и морепродукты могут быть инфицированы этим возбудителем из воды, ила, прибрежной почвы, сточных вод. Употребление в пищу инфицированных продуктов может вызвать серьезную пищевую интоксикацию (Мазохина-Поршнякова, 1977; Вербина, 1980; Покровский и др., 1999; Перетрухина, 2001; Cann, 1965; Presnell, 1967; Christiansen, 1968; Craig, 1968; Houghtby, Kaysner, 1969).
Для определения спорообразующих клостридий существуют различные методы: с использованием дифференциально-диагностических питательных сред, с добавлением антибиотиков (Сидоренко, Пивоваров, 1968); метод мембранных фильтров (Артемова, 1973) и методы посева на жидкие и твердые питательные среды (Перетрухина, Белокопытова, 1987; Перетрухина, 2001).
Патогенные клостридии обладают способностью вызывать пищевые токсикоинфекции, поэтому для санитарной оценки питьевой воды более показательным и важным по сравнению с БГКП является тест на определение Cl. perfringens. Для определения эффективности очистки сточных вод и качества водоемов ниже их сброса этот показатель является также приоритетным.
Род Васillus
Бактерии рода Васillus (B. anthracis (Поллендер, Брауэлл, 1849; Давэн, 1850), B. сereus, B. subtilis и др.) широко распространены в природе, встречаются в почве, воде, на различных объектах внешней среды (Мишустин, 1975). Эти микроорганизмы впервые были описаны Поллендером и Брауэллом, Давеном, чистую культуру бацилл впервые выделил Р. Кох в 1876 году (Покровский, 1999).
Бактерии рода Васillus (B. сereus) относятся к условно-патогенным микроорганизмам, способным стать причиной пищевых отравлений. Это связано с воздействием на организм продуктов расщепления белка под влиянием протеолитических ферментов, вырабатываемых этим микроорганизмом. Этот почвенный аэроб может попадать из почвы в водные объекты. B. сereus постоянно обнаруживают в воде открытых водоемов в количестве от тысячи до десятков тысяч в 1 л. Его также выделяют в водопроводной воде, причем его численность оказывается выше, чем количество БГКП, что связано с его повышенной устойчивостью к действию дезинфицирующих средств (Волкова, 1971; Мазохина-Поршнякова и др., 1977; Пяткин, 1981; Перетрухина, Белокопытова, Ведерникова, 1987; Перетрухина, 1998).
Таким образом, определение количества B. сereus и его идентификация в водных объектах необходимы.
.3 Грамположительные неспорообразующие палочки
К грамположительным неспорообразующим палочкам относятся бактерии рода Listeria.
Род Listeria
Вид Listeria monocytogenes открыт в 1926 году Э. Мареем и назван в 1940 году Г. Пири в честь Д. Листера Listeria (Пяткин, 1981). В естественных условиях к листериозу восприимчивы мелкий и крупный рогатый скот, свиньи, лошади, куры. Носителями патогенных листерий обычно являются грызуны. Листерии могут быть причиной инфекционных болезней животных и человека. В почве бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 5 дней, в воде - от 10 дней до нескольких месяцев; резистентны к замораживанию и воздействию химических веществ (Тимаков, 1973; Определитель бактерий Берджи, 1997; Перетрухина, Богданова, 1997; Перетрухина, Богданова, 2000).
.4 Дрожжевые и плесневые грибы
Естественными обитателями морской воды и поверхности гидробионтов являются дрожжевые и плесневые грибы, которые широко распространены в окружающей среде. Спорообразование способствует сохранению этих микроорганизмов при неблагоприятных условиях окружающей среды. При попадании в благоприятную для развития среду споры прорастают в вегетативную клетку (Вербина, 1980; Шлегель, 1992).
Типичными представителями дрожжей являются роды Candida, Criptococcus, Torylopsis, Rhodotorula, Saccharomyces (Красильников, 1949; Тимаков, 1973; Определитель бактерий Берджи, 1997; Перетрухина, 1987, 1999). Группа плесневых грибов состоит из класса Phicomycetes семейства Mucoroceae (представители Mucоr, Rhizopus, Fhamnigium) и класса Ascomycetes семейства Aspergillaceae (представители Aspergillus и Penicillium) (Красильников, 1980).
Среди токсических веществ, продуцируемых плесневыми грибами, особый интерес для исследователей предсталяют афлатоксины. Многочисленными опытами установлено, что они являются одними из наиболее сильных гепатотоксинов и гепатоканцерогенов. Афлатоксины - термоустойчивые органические соединения, не разрушающиеся при автоклавировании.
В настоящее время выяснена химическая структура афлатоксинов - лактокумариновых соединений с элементарным составом С17Н12О6 и C17H12O7. Продуценты афлатоксинов широко распространены в природе. Наиболее сильными продуцентами афлатоксинов являются грибы рода Aspergillus (Богданов и др., 1969, Мазохина-Поршнякова, 1977; Перетрухина, 2001).
2.5 Нокардиоформные актиномицеты
В составе гетеротрофного бактериопланктона большинства акваторий наиболее часто исследователи выявляют бактерии рода Rhodococcus, относящихся к нокардиоформным актиномицетам. Эти бактерии устойчивы во внешней среде, способны к углеводородному окислению (Коронелли, Дермичева, Ильинский, 1997). Это бактерии, содержащие миколовые кислоты, способные образовывать различные формы от палочек до кокков, нити разветвленного вегетативного мицелия с боковыми выростами, воздушные гифы. Бактерии рода Rhodococcus грамположительные, аэробные, кислотоустойчивые, широко распространены в объектах окружающей среды. Некоторые представители патогенны для животных и человека (Определитель бактерий Берджи, 1997).
Определение этих микроорганизмов в воде необходимо для достоверного микробиологического мониторинга водных объектов.
.6 Бактерии группы кишечной палочки
Существуют различные мнения относительно использования бактерий группы кишечной палочки (БГКП) в качестве индикаторных бактерий (Мицкевич, 1949; Киченко, Корш, Киченко, 1952; Киченко, 1957; Чистович, 1969; Багдасарьян, Ловцевич, 1972; Киселева, Голубева, 1973; Перетрухина, Овчинникова, Богданова, 1999; МР № 1, 2001; Chapman, 1951).
Для определения бактерий этой группы используют титрационные, или «бродильные» методы (Корш, 1953; Перетрухина, 1984, 1998; МР № 1, 2001); мембранные методы (Барсов, 1931, 1937; Киченко, 1948; Дааль-Берг, Большаков, Бодарев, 1955, Richards, Krabek, 1954; Wittfogel, 1956; Taylor, Burman, Oliver, 1957; Sharpe, Michaud, 1974, 1975); методы определения наиболее вероятного числа (НВЧ), основанные на посеве различных объемов исследуемой воды в жидкие среды накопления (Перетрухина, 1987, 1999; МР № 1, 2001); методы определения способности роста и газообразования с последующим высевом на плотные дифференциальные среды (или жидкие с ингибиторами) и дальнейшим подтверждением ферментативной способности (Андреева, 1959; Блинкин, 1963).