Статья: Молекулярная эпидемиология штаммов Burkholderia cepacia complex, выделенных от пациентов с муковисцидозом, в Российской Федерации

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ШТАММОВ BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ, В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Юлия Бочарова, Александр Жестков,

Артем Лямин, Ольга Кондратенко, Татьяна Савинова,

Светлана Поликарпова, Наталья Федорова,

Николай Маянский, Игорь Чеботарь

Аннотация

Представлены выделенные от российских пациентов с муковисцидозом молекулярные характеристики изолятов Burkholderia cepacia complex, включая их клональную принадлежность и носительство генов адаптивной резистентности. Среди представителей Burkholderia cepacia complex, колонизирующих респираторный тракт пациентов с муковисцидозом, преобладающим видом стали изоляты Burkholderia cenocepacia (83 %). Клональная принадлежность буркхолдерий отличалась значительным разнообразием - изоляты принадлежали к 10 сиквенс-типам. Для 3 изолятов Burkholderia cenocepacia были описаны новые сиквенс-типы.

Ключевые слова: Burkholderia cepacia complex, муковисцидоз, антибиотикорезистентность, гены, сиквенс-типы

Annotation

MOLECULAR EPIDEMIOLOGY OF BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS WITH CYSTIC FIBROSIS IN THE RUSSIAN FEDERATION

Yuliya A. Bocharova, Aleksandr V. Zhestkov, Artem V. Lyamin, Olga V. Kondratenko, Tatiana A. Savinova, Svetlana V. Polikarpova, Natalia I. Fedorova, Nikolay A. Mayansky, Igor V. Chebotar

Molecular characteristics of Burkholderia cepacia complex isolates isolated from Russian patients with cystic fibrosis are presented, including their clonal affiliation and carrying adaptive resistance genes The most prevalent species of Burkholderia cepacia complex recovered from cystic fibrosis patients was Burkholderia cenocepacia (83 %). Burkholderia strains displayed a high level of clonal diversity - ten sequence types were detected among examined isolates. Three new Burkholderia cenocepacia sequence types were discovered.

Keywords: Burkholderia cepacia complex, cystic fibrosis, antibiotic resistance, genes, sequence type

Введение

Бактерии Burkholderia cepacia complex (BCC) принадлежат к числу опасных микроорганизмов, усугубляющих поражение легких при муковисцидозе (МВ) [1]. Часто BCC приводит к развитию смертельно опасного осложнения «cepaciaw-синдрома, которое ассоциировано с прогрессирующим поражением легких и септицемией [2]. Появление BCC-бактерий в респираторных образцах пациентов расценивается в качестве негативного критерия при прогнозировании течения МВ и требует незамедлительной коррекции лечебного процесса [3]. Бактерии BBC способны быстро передаваться от пациента к пациенту, что служит причиной вспышек буркхолдериальной инфекции [4]. Считается, что среди клонов BCC существуют более опасные, так называемые «успешные» клоны, с которыми связано наибольшее количество тяжелых случаев поражения легких при МВ [5]. Именно поэтому исследование молекулярных характеристик, которые являются не только индикаторами тяжести клинического течения и эпидемиологического процесса, но и основой вирулентности и резистентности буркхолдерий, представляет собой актуальную задачу медицинской науки.

Известно, что в странах Западной Европы у пациентов МВ распространены сиквенс-типы (ST) ST218, ST220, ST234, ST280, ST309, ST359, ST363, ST364, глобальное распространение получили ST28 и ST32 [5].

Цель: определить видовую и клональную принадлежность изолятов Burkholderia cepacia complex, выделенных от пациентов с муковисцидозом в Российской Федерации (РФ), а также выявить среди этих изолятов носительство и интегронную организацию генов адаптивной резистентности.

Материалы и методы исследования

burkholderia cepacia complex муковисцидоз

Объектами исследования стали штаммы бактерий BCC, выделенные из мокроты и верхних дыхательных путей (мазок со слизистой глубоких отделов задней стенки глотки) пациентов с МВ из 48 регионов РФ в возрасте от 1 года до 33 лет в январе-феврале 2020 г. Общее число обследованных пациентов составило 168 человек, что соответствует 5,3 % от общего числа пациентов с МВ в РФ [6]. Родовую принадлежность штаммов определяли при помощи времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOFMS, Vitek-MS, bioMereux).

Бактериальную ДНК выделяли из культур исследуемых штаммов BCC, выращенных на кровяном агаре («Becton Dickinson», США), с использованием наборов QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen», Нидерланды ) по протоколу фирмы-производителя. Образцы ДНК хранили при -20° C.

ДНК-библиотеки готовили при помощи ультразвуковой фрагментации (Covaris) бактериальной ДНК (400 нг) с последующей репарацией концевых последовательностей и лигированием адаптеров (MGI). Для измерения концентрации бактериальной ДНК и ДНК-библиотек использовали прибор Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, США). Очистку ДНК-библиотек проводили с применением магнитных частиц Agencourt AMPure XP («Beckman Coulter», США).

Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе MGISEQ-2000 (MGI) с длиной прочтений 250 пар оснований. Для сборки бактериального генома использовали программу SPAdes 3.14 [7]. Для контроля полноты сборки и исключения возможности контаминации применяли вебсервер Contest16S и программу CheckM [8, 9]. Оценку качества сборки проводили при помощи QUAST 5.0 [10]. Для анализа геномов использовали сервисы Galaxy, ResFinder и базу данных Integrall (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder; https://usegalaxy.org.au; http://integrall.bio.ua.pt). Видовую идентификацию проводили на основе определения аллелей генов gyrBrnecA [11]. Сиквенс-тип изолятов определяли в соответствии со стандартной схемой мультилокусного сиквенс-типирования для бактерий BCC с использованием данных полногеномного секвенирования (https://pubmlst.org/organisms/burkholderia-cepacia-complex).

Результаты исследования и их обсуждение

Бактерии BCC были обнаружены у 13/168 (7,7 %) пациентов, при этом у 9 пациентов было выделено по 1 изоляту, у 3 обследованных - по 2 изолята, у 1 больного - 3 штамма (табл.).

Таблица

Виды и сиквенс-типы бактерий Burkholderia cepacia complex, выделенных от пациентов с МВ Table. Species and sequence types of Burkholderia cepacia complex bacteria isolated from patients with cystic fibrosis

Примечание: * - однолокусный вариант

Всего было обнаружено 18 штаммов бактерий BCC: 15/18 (83%) штаммов принадлежали к виду Burkholderia cenocepacia, остальные 3 штамма принадлежали к виду Burkholderia stabilis.

Среди исследованных изолятов было выявлено 10 сиквенс-типов: 3 из них обнаружены впервые, 2 из новых сиквенс-типов являлись однолокусными вариантами (SLV) ST709 и ST1742. Один новый ST1880 особенно сильно отличался от известных вариантов, так как его аллельный профиль имел 5 ранее неизвестных последовательностей «house-keepingw-генов, определяющих ST6: atpD (645), gltB (836), gyrB (1211), phaC (609), trpB (764).

Каждый из сиквенс-типов ST1880, ST241, ST627, ST862, SLVST709 и SLVST1742 был представлен одним изолятом, все они были выделены от разных пациентов. ST208 был представлен 5 изолятами, выделенными от 3 пациентов, ST709 - 3 изолятами, выделенными от 2 пациентов (табл.). ST1565 и ST643 были представлены парами изолятов, каждая из которых была выделена от 1 пациента. Число однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), выявленных при сравнении геномов штаммов 1 сиквенстипа, выделенных от 1 пациента, было > 20, что подтверждало штаммовое различие изолятов.

У 4 штаммов (B. cenocepacia 41774/2, 41774/4, 123/3 и 321) были обнаружены гены адаптивной резистентности - гены аминогликозидфосфотрансфераз APH(3'')-Ib и APH(6)-Id. У штамма B. cenocepacia 321, помимо генов аминогликозидфосфотрансфераз, обнаружены гены аминогликозидмодифицирующего фермента ANT(2'')-Ia и устойчивой к сульфаниламидам дигидроптероатсинтазы (sul1). Гены ant(2'')-Ia(aadB) и sul1 находились в составе интегрона класса 1. Интегрон состоял из трех частей: вариабельного региона и 5'и 3'-консервативных сегментов (рис.). Вариабельный регион был представлен генной кассетой ant(2'')-Ia и имел размер 750 пар оснований; 5'консервативный сегмент был представлен геном интегразыШ1, 3'-консервативный сегмент - генами qacEА1, sull и открытой рамкой считывания orf5.

Рис. Строение аШ(2”)-Іа-несущего интегрона, обнаруженного в геноме штамма Burkholderia cenocepacia 321 Fig. Structure of the ant(2")-Ia-bearing integron found in the genome of Burkholderia cenocepacia 321 strain

Примечание: серым цветом показаны консервативные сегменты интегрона, белым - вариабельный регион

В проведенном исследовании бактерии BCC были обнаружены у 7,7 % пациентов с МВ, что соответствует данным отечественных и европейских исследований, однако превышает соответствующий показатель, зарегистрированный среди пациентов с МВ в США [6, 12, 13]. Видовой состав исследованных бактерий BCC, хотя и был менее разнообразен, не отличался в количественном отношении от результатов отечественных работ предыдущих лет. По данным российских авторов, преобладающим видом среди бактерий BCC, выделенных от пациентов с МВ, является вид B. cenocepacia (45,3-85,5 %), доля каждого из других видов (Burkholderia stabilis, Burkholderia multivorans, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia contaminans) составляет не более 28 % [14, 15]. В разных странах преобладают разные виды бактерий BCC, например, в Аргентине у пациентов с МВ чаще всего высевают B. contaminans, в Великобритании - B. multivorans [16, 17].

В соответствии с базой данных PubMLST, большинство выявленных сиквенс-типов ранее уже были зарегистрированы у российских пациентов с МВ (https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_Bcc_isolates&page=query). Исключение составили впервые выявленные на территории РФ ST643, ST1565 и новые сиквенс-типы ST1880, SLV ST709 и SLV ST1742. Один из обнаруженных сиквенс-типов - ST709 - имеет доказанное эпидемическое значение для пациентов с МВ [14].

Примечательным результатом проведенного исследования стало обнаружение у нескольких пациентов более 1 штамма бактерий BCC, при этом штаммы, выделенные от 1 пациента, принадлежали к 1 сиквенс-типу. В исследовании I.N. Silva и соавторов на примере B. multivorans показано, что бактерии BCC непрерывно эволюционируют в дыхательной системе пациентов с МВ [18]. Полученные в представленном исследовании результаты косвенно подтверждают, что выделение нескольких штаммов бактерий BCC от 1 пациента является результатом эволюции внутри дыхательных путей, а не следствием колонизации новыми штаммами из окружающей среды или от других пациентов.

Обнаруженные у исследованных изолятов гены адаптивной резистентности aph(3")-Ib, aph(6)-Id,ant(2'')-Ia (aadB) и sul1, в соответствии с базой данных CARD, ранее были описаны у бактерий BCC (https://card.mcmaster.ca/home). Ген ant(2'')-Ia (aadB) был выявлен у штамма BCCNF912624 в составе интегрона класса 1, как и в данном исследовании. Однако, в отличие от обнаруженного интегрона, содержащего только 1 генную кассету ant(2'')-Ia, интегрон, описанный в базе Genbank, содержал 3 генные кассеты ant(2'')-Ia, aac6-II и bla_PSE_i (номер GenBank HQ880250.1). Консервативные сегменты интегрона класса 1, выявленного в представленной работе, имели классическое строение. В состав 5'-консервативного сегмента входил ген интегразы intI1, 3'-консервативный сегмент состоял из 3 генов: гена qacEA1, продукт которого представляет собой неполную версию белка, обеспечивающего устойчивость к детергентам, гена дигидроптероатсинтазы, устойчивой к сульфаниламидам (sull), и открытой рамки считывания orf5, предположительно кодирующей ацетилтрансферазу [19]. Наиболее близкий по строению интегрон In7 был детектирован в составе плазмиды pKS77, описанной в исследовании H. Heuer и соавторов [20].

Заключение

Исследование показало, что среди представителей Burkholderia cepacia complex, колонизирующих респираторный тракт пациентов с муковисцидозом, преобладающим видом были изоляты Burkholderia cenocepacia (83 %). Клональная принадлежность Burkholderia cepacia complex отличалась значительным разнообразием - изоляты принадлежали к 10 сиквенс-типам. В работе получены косвенные доказательства дивергентной эволюции буркхолдерии внутри дыхательных путей, приводящей к образованию новых штаммов.

Список источников

1. Jones A. M., Dodd M. E., Govan J. R., Barcus V, Doherty C. J., Morris J., Webb A. K. Burkholderia cenocepacia and Burkholderia multivorans: influence on survival in cystic fibrosis // Thorax. 2004. Vol. 59, no. 11. P 948-951.

2. Nash E. F., Thomas A., Whitmill R., Rashid R., Barker B., Rayner R. J., Whitehouse J. L., Honeybourne D. «Cepacia syndrome» associated with Burkholderia cepacia (genomovar I) infection in an adolescent with cystic fibrosis // Pediatric pulmonology. 2011. Vol. 46, no. 5. P. 512-514.

3. Lynch J. P. Burkholderia cepacia complex: impact on the cystic fibrosis lung lesion // In Seminars in respiratory and critical care medicine. 2009. Vol. 30, no. 5. P. 596-610.

4. Whiteford M. L., Wilkinson J. D., McColl J. H., Conlon F. M., Michie J. R., Evans T. J., Paton J. Y. Outcome of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia colonisation in children with cystic fibrosis following a hospital outbreak // Thorax. 1995. Vol. 50, no. 11. P. 1194-1198.

5. Drevinek P, Mahenthiralingam E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence // Clinical Microbiology and Infection. 2010. Vol. 16, no. 7. P. 821-830.

6. Данные с сайта Всероссийской ассоциации для больных муковисцидозом. Регистр больных муковисцидозом в РФ. URL:https://mukoviscidoz.org/doc/registr/site_Registre_2019.pdf.

7. Bankevich A., Nurk S., Antipov D., Gurevich A. A., Dvorkin M., Kulikov A. S., Lesin V. M., Nikolenko

8. S. I., Pham S., Prjibelski A. D., Pyshkin A. V., Sirotkin A. V., Vyahhi N., Tesler G, Alekseyev M. A., Pevzner P. A. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing // Journal of Computational Biology. 2012. Vol. 19, no. 5. P 455-477.