Автореферат: Молекулярно-генетический анализ тапеторетинальной абиотрофии в Республике Башкортостан

Установлено, что последние 5 аминокислот в молекуле родопсина (позиции 354-358) необходимы для правильной сортировки и транспорта RHO от комплекса Гольджи к дискам наружных сегментов фоторецепторов (Green E.S. et al., 2000). Нарушение этих процессов ведет к быстрой дегенерации фоторецепторов, поэтому пациенты с мутациями в С-концевой части родопсина (мутация P347L) имеют более быстрые темпы прогрессирования заболевания, чем пациенты с мутациями, поражающими другие участки молекулы RHO (Berson E.L. et al. 2002).

Рисунок 2. Электорофореграмма рестрикционного анализа и фрагмент сиквенса 5 экзона гена RHO: дорожки 1,2 - образцы с мутацией P347L в гетерозиготном состоянии, дорожка 3 - образец без изменения нуклеотидной последовательности.

Другая мутация - R252P гена RHO в литературе не описана. Она выявлена у трех членов одной семьи татарской этнической принадлежности с диагнозом ТРА, смешанная форма (рис. 3).

Рисунок 3. Фрагмент сиквенса 4 экзона гена RHO. Нуклеотидная последовательность образца с мутацией R252P в гетерозиготном состоянии: а) секвенирование с прямым праймером, б) секвенирование с обратным праймером.

Так как кодон 252 входит в участок связывания G-белка - трансдуцина (кодоны 231-252), изменение аминокислотного состава в этом участке: замена основной кислоты аргинина на нейтральную гидрофобную кислоту пролин, может изменять свойства белковой молекулы, влиять на присоединение трансдуцина и дальнейшую активацию ферментного каскада.

Кроме двух мутаций, в гене RHO обнаружено два изменения нуклеотидной последовательности в интронных областях: IVS1+10g>a в 1 интроне и IVS3+4c>t в 3 интроне. Изменение IVS1+10g>a ранее в литературе не описано. Оно выявлено в гетерозиготном состоянии у одной больной русской этнической принадлежности с диагнозом ТРА, периферическая форма. В группе контроля данное изменение не обнаружено. Другое изменение нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t гена RHO, выявленное при SSCP-анализе ведет к потере одного из сайтов рестрикции для эндонуклеазы RsaI. Для дальнейшего анализа данного изменения был использован ПДРФ-анализ (рис. 4). С помощью программы Splice Prediction using Consensus Sequences (WebGene) было установлено, что шесть первых нуклеотидов 3-го интрона образуют один из сайтов сплайсинга гена RHO. Учитывая вышеизложенное, можно предположить участие IVS3+4c>t в патогенезе ТРА, одним из механизмов которого может быть нарушение процессов сплайсинга.

Рисунок 4. Электорофореграмма ПДРФ-анализа 3 экзона гена RHO: дорожки 1-3 образцы без изменений нуклеотидной последовательности, дорожка 4 - образец с изменением нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t в гетерозиготном состоянии.

Частота данного изменения нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t у больных составила 0,34±0,03, что достоверно выше, чем у здоровых индивидов 0,06±0,01 (ч²=63,4; р=0,0005) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот аллелей и генотипов изменения нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t гена RHO у больных с ТРА и в контрольной выборке из РБ

Также было проанализировано распределение частот аллелей и генотипов изменения IVS3+4c>t гена RHO в трех основных этнических группах РБ (русских, татар и башкир). Частота IVS3+4c>t в этих этнических группах соответствует значению, полученному при анализе частоты этого изменения у здоровых индивидов из контрольной группы, и составляет, в среднем, 0,06. Изменение нуклеотидной последовательности IVS3+4c>t гена RHO в гомозиготном состоянии ни в группе больных ТРА, ни в группе контроля, выявлено не было.

3. Поиск мутаций в гене трансретинальацетилазы RPE65 у больных с тапеторетинальной абиотрофией из Республики Башкортостан

При скрининге мутаций в кодирующих областях, сайтах сплайсинга и прилегающих интронных областях гена RPE65 (14 экзонов) методом SSCP-анализа были обнаружены мутации R91W и 927delC, полиморфизм 1056G>A. Мутация R91W, в гомозиготном состоянии вызывающая развитие амавроза Лебера, была обнаружена также в гомозиготном состоянии у пациентки с диагнозом амавроз Лебера. Мать больной являлась гетерозиготным носителем этой мутации и не имела никаких признаков глазной патологии (рис. 5).

Рисунок 5. Фрагмент сиквенса 4 экзона гена RPE65: а) нуклеотидная последовательность образца с мутацией R91W в гомозиготном состоянии; б) нуклеотидная последовательность образца с мутацией R91W в гетерозиготном состоянии.

Мутация 927delС, не описанная ранее в литературе, была выявлена в гетерозиготном состоянии в сочетании с мутацией R252P гена RHO у 3 пациентов с ТРА татарской этнической принадлежности из одной семьи (рис. 6). У всех 3 пациентов из одной семьи, несущих эти мутации наблюдается клиническая картина ТРА, смешанная форма. Манифестация заболевания произошла во второй декаде жизни в виде прогрессирующего нарушения сумеречного зрения, с течением времени наблюдалось нарастающее сужение полей зрения по периферии, глазное дно характеризовалось отложением «костных телец» по периферии сетчатки и крапчатостью в области макулы, отмечалось снижение остроты зрения и показателей электроретинографии.

Сделать какое-либо предположение о функциональной роли сочетания этих мутаций в двух разных генах пока достаточно трудно. Обе мутации выявлены в гетерозиготном состоянии. Мутация 927delC в гене RPE65 ведет к преждевременной терминации синтеза белка в результате образования стоп-кодона в 9 экзоне (всего 14 экзонов). Мутация R252P в гене RHO может также участвовать в патогенезе ТРА путем влияния на активацию ферментного каскада вследствие нарушения связывания белка трансдуцина. Следовательно, развитие ТРА у данных больных может быть результатом как отдельного проявления одной из мутации, так и следствием их совместного влияния. В литературе уже описаны случаи дигенного варианта ТРА (Loewen, C. J. R. et al., 2001). Необходимо дальнейшее изучение механизмов, с помощью которых эти мутации могут приводить к развитию ТРА на животных моделях.

R252P в гене RHO 927delС в гене RPE65

Рисунок 6. Родословная семьи больных ТРА из РБ с указанием двух новых мутаций, выявленных у трех членов этой семьи: 5 - пробанд, несущий в гетерозиготном состоянии две новые мутации: R252P в гене RHO и 927delC в гене RPE65; 6 и 3 - сестра и отец пробанда, которые также являются носителями двух новых мутаций: R252P в гене RHO и 927delC в гене RPE6; 4 - мать пробанда, у которой отсутствуют данные мутации.

Нейтральный полиморфизм 1056G>A, выявленный при исследовании гена RPE65, встречается с частотой 0,04±0,01 на хромосомах здоровых индивидов из группы контроля и с частотой 0,03±0,01 на хромосомах больных с ТРА (ч²=0,58; р=0,45).

4. Поиск мутаций в гене периферина (RDS/PRPH2) у больных с тапеторетинальной абиотрофией из Республики Башкортостан

Анализ кодирующих областей, сайтов сплайсинга и прилегающих интронных областей гена периферина (3 экзона) выявил 6 полиморфных вариантов. Два из них, 318T>C и 1426G>A 3'-UTR, не являются патогенетически значимыми. Полиморфизм 318T>C не приводит к изменению аминокислотной последовательности белка (V106V), частота аллеля *C полиморфизма 318T>C в группе больных ТРА и в группе контроля из РБ составила 0,26±0,028 и 0,33±0,029, соответственно (ч²=2,39; р=0,12). Полиморфизм 1426G-A 3'-UTR находится в некодирующей части 3 экзона гена RDS, его частота в группе больных ТРА - 0,23±0,027, в группе контроля - 0,27±0,027 (ч²=1,02; р=0,31). Четыре полиморфных варианта в позициях 910C>G(Q304E), 929G>A(R310K), 1013A>G(D338G) и 1054C>T 3-го экзона гена RDS/PRPH2 (рис. 7), по данным литературы, могут образовывать различные группы сцепления или минигаплотипы, 4 из которых были установлены ранее: *G⁹¹⁰*A⁹²⁹*G¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴ (аллель I), *C⁹¹⁰*A⁹²⁹*A¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴ (аллель II), *C⁹¹⁰*G⁹²⁹*A¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴ (аллель III) и *G⁹¹⁰*A⁹²⁹*G¹⁰¹³*T¹⁰⁵⁴ (аллель IV) (Telmer C.A. et al., 2003).

При обследовании больных ТРА и группы контроля из РБ кроме четырех известных, был выявлен 5-й минигаплотип *C⁹¹⁰*A⁹²⁹*A¹⁰¹³*T¹⁰⁵⁴ (аллель V) в группе больных ТРА. Сочетания 5-ти минигаплотипов образуют 7 вариантов генотипов в группе больных ТРА и в группе здоровых индивидов из РБ (табл. 2).

Таблица 2

Генотипы 3 экзона гена RDS, выявленные у больных с ТРА и в группе контроля из Республики Башкортостан

Наиболее частыми генотипами, как в группе больных, так и в группе контроля из РБ являются генотипы 4 (*G/*G⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *G/G¹⁰¹³ *T/*T¹⁰⁵⁴) и 5 (*C/*G⁹¹⁰ *G/*A⁹²⁹ *A/*G¹⁰¹³ *C/*T¹⁰⁵⁴). Частота 4 генотипа составляет 0,62 в группе больных ТРА и 0,44 в группе контроля (ч2=7,1, p=0,008). Генотип 5 встречается достоверно чаще в группе контроля 0,37, по сравнению с группой больных ТРА 0,06 (ч2=32,25, p=0,0005). Три генотипа: *C/*C⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *A/*A¹⁰¹³ *C/*C¹⁰⁵⁴ (2), *C/*C⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *A/*A¹⁰¹³ *C/*T¹⁰⁵⁴ (6) и *C/*G⁹¹⁰ *A/*A⁹²⁹ *A/*G¹⁰¹³ *C/*T¹⁰⁵⁴ (7) не встречаются в группе контроля. Второй, шестой и, возможно, седьмой генотипы содержат минигаплотип II - *C⁹¹⁰*A⁹²⁹*A¹⁰¹³*C¹⁰⁵⁴, описанный в 2003 году (Telmer C.A. et al., 2003). Есть данные о сцеплении минигаплотипа II с мутацией сайта сплайсинга 2-го интрона гена RDS IVS2+3a>t (Telmer C.A. et al., 2003). При секвенировании 2-го интрона гена RDS всех образцов ДНК больных, предположительно содержащих минигаплотип II, никаких изменений нуклеотидной последовательности в этой области выявлено не было.

5. Разработка формализованной карты обследования больных с ТРА и создание автоматизированного регистра «Тапеторетинальная абиотрофия» в Республике Башкортостан

При проведении анализа состояния здоровья населения, планирования необходимой медико-социальной помощи и медико-генетического консультирования требуется учитывать множество разнообразных данных. Для систематизации и стандартизации этой информации необходима разработка типовой медицинской документации. Нами была составлена формализованная карта (ФК) обследования пациентов с ТРА, которая послужила основой для последующей разработки автоматизированного регистра «Тапеторетинальная абиотрофия». ФК состоит из пяти частей: паспортной, генеалогической, анамнестической, клинической и лабораторно-инструментальной, каждая из которых делится на разделы и подразделы. ФК заполняется врачом-офтальмологом и врачом-генетиком на основе информации, полученной непосредственно от пациента, его родственников и данных медицинской документации. ФК может быть использована и для первичной диагностики ТРА, и для дифференциального диагноза, так как разработана на основе общепринятых диагностических критериев ТРА. В процессе наблюдения за пациентами возможно изменение и пополнение данных в соответствии с новыми сведениями. ФК удобна для обследования пациентов на дому и во время выездов в районы по их месту жительства. Однако обследование больных с наследственными заболеваниями имеет свои специфические особенности. Врачу приходится иметь дело с большим объемом информации, так как необходимо обследовать не только больных, но по возможности и большинство их родственников. Так же требуется анализ заболевания по многочисленным разнообразным показателям, динамическое наблюдение за пациентами и проведение повторных обследований, составление отчетов для ЛПУ. Поэтому актуальным является разработка автоматизированного регистра, позволяющего хранить и анализировать большое количество информации. На основе ФК нами разработан и внедряется в действие на базе ГУ Уфимского научно-исследовательского института глазных болезней АНРБ автоматизированный регистр «Тапеторетинальная абиотрофия».