Материал: Моноклональные антитела Учебно-методическое пособие для аспирантов и студентов высших учебных заведений

Рис. 1 – Получение моноклональных антител

Некоторые из антитело-продуцирующих клеток селезенки и клетки миеломы сливаются, образуя гибридные клетки. Эти гибридные клетки способны непрерывно расти в культуре, а так же продуцировать антитела.

Мыши вводят антиген, который вызывает продукцию специфических антител против этого антигена.

Селезенку мышей удаляют и гомогенизируют для получения суспензии клеток. Эта суспензия содержит B клетки, которые продуцируют антитела против введенного антигена.

Клетки селезенки смешивают с клетками миеломы, которые способны непрерывно расти в культуре, а так же отсутствует резервный путь синтеза нуклеотидов.

Смесь клеток помещают в селективную среду, которая позволяет расти только гибридным клеткам. Погибают не слившиеся миеломные клетки и В-

лимфоциты.

Гибридные клетки пролиферируют, образуя клон гибридом. Гибридомы проверяют на продукцию нужных антител.

Выбранные гибридомы затем культивируют для получения больших количеств моноклональных антител.

Рис. – 2 Основные этапы получения гибридомы

Примечание: А, В, С - многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации

(или сложные антигены с множеством антигенных детерминант);

АОК - антителообразующие клетки селезенки;

Пл - клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТсреде;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

ГАТ - среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин;

анти-А, анти-В, анти-С - моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам (или антигенным детерминантам).

Если в среду для культивирования внести вещество, блокирующее основной путь синтеза нуклеотидов в клетке - аминоптерин, то на данной среде миеломные клетки, у которых отсутствует фермент (Г/ГФРТ), не способны обеспечить синтез нуклеиновых кислот и будут погибать. Мутантные клетки гибридомы - лишены резервного пути синтеза нуклеотидов и в среде с гипоксантином они погибают. Задача селекции сводится к отделению гибридом от миеломных неслившихся клеток. Для решения этой задачи используют селективную среду ГАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин - аминоптерин - тимидин). В такой среде, содержащей аминоптерин, блокируется основной путь синтеза нуклеотидов, а наличие гипоксантина и тимидина обеспечивает синтез нуклеотидов по запасному пути. В таких условиях миеломные клетки погибают и остаются функционально активными только гибридомы. В-лимфоциты не адаптированы к росту in vitro, они достаточно быстро разрушаются, что облегчает процесс селекции.

СЕЛЕКЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ПРОДУКЦИЯ АНТИТЕЛ

Широко используется два методических подхода: клонирование методом предельных (лимитирующих) разведений и клонирование в полужидком агаре. В первом случае готовят разведения в ростовой среде, содержащей 1-3

клетки на 0,5 мл и рассаживают по 100 мкл в лунки 96 – луночных пластин,

либо 96-луночных пластин, либо клетки рассеивают из расчета одна клетка на лунку. При клонировании в полужидком агаре, гибридные клетки вносят в 0,5 % раствор агара, приготовленный на культуральной среде. Клетки при этом способе обычно вносят в агар из расчета 2040 клеток на лунку 24-х

луночной пластины.

Через 7 -10 дней образовавшиеся клоны переносят в лунки 96луночных пластин контролируя все действия на микроскопе. Сформировавшуюся популяцию клеток после клонирования тестируют.