Пособие для самоподготовки к итоговому занятию по разделу
«Морфология и физиология микроорганизмов»
Минск 2005
1. Характеристика бактериоскопического метода исследования
Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования - совокупность способов изучения морфологических и тинкториальных (способность окрашиваться) свойств микробов в исследуемом материале (лабораторная культура, патологический материал, пробы из внешней среды) с помощью микроскопии.
Основная цель - установление этиологии болезни, морфологическая идентификация, а также определив чистоты выделенной чистой культуры.
В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов:
а) бактериологический мазок (препарат-мазок);
б) "висячая капля";
в) "придавленная капля";
г) тонкий мазок;
д)"толстая капля";
ж) препарат-отпечаток.
Этапы метода:
1. Забор материала (гной, мокрота, кровь, моча, испражнения, промывные воды бронхов и желудка, ликвор, содержимое полостей носа, вагины, трупный материал и др.).
2. Транспортировка материала.
3. Приготовление микропрепаратов, фиксация и окраска (при необходимости).
4. Микроскопия с оценкой формы, размеров, взаимного расположения микробов и т.д.
5. Заключение.
Оценка метода: Метод прост, широко доступен, быстр, экономичен, но мало чувствителен
(около 104-105 бактерий в мл) и специфичен (из-за схожести морфологии микроорганизмов разных видов), небезопасен.
2. Световые микроскопы. Принципы устройства простого, фазовоконтрастного, темнопольного, люминесцентного микроскопов и их применение в микробиологии. Техника иммерсионной микроскопии
Размеры микробов, имеющих клеточное строение, составляют 0.2 -- 20 мкм (чаще 0,5 -- 10 мкм) и они легко обнаруживаются в иммерсионном микроскопе. Вирусы во много раз меньше. Диаметр самых больших из них, например вируса натуральной оспы, около 300 нм, а у самых мелких составляет 20 -- 30 нм. Ввиду этого для выявления вирусов используются электронные микроскопы. В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы; методы оптической и электронной микроскопии.
Оптический микроскоп. Наиболее важной оптической частью микроскопа являются объективы, которые по способу использования и степени увеличения делятся на сухие и иммерсионные. Сухие объективы с относительно большим фокусными расстоянием и слабым увеличением применяются для изучения микроорганизмов, имеющих крупные размеры (более 10 -- 20 мкм), иммерсионные с фокусным расстоянием 1,5 -- 3 мм -- при исследовании более мелких микробов.
При микроскопии иммерсионным объективом х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или при их отсутствии в вазелиновое масло, показатели преломления света у которых близки предметному стеклу, на котором делают препараты (мазки). В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм, а максимальное увеличение объекта достигаем 1350.
При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Если тубус микроскопа раздвижной, его устанавливают на длину 160 мм, затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив х8 и при помощи плоского зеркала освещают поле зрения. На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем глаза осторожно погружают объектив, затем, поднимая тубус, смотрят в окуляр и вначале макро-, а потом микровинтом устанавливают четкое изображение объекта. По окончании работы поднимают тубус, снимают препарат, салфеткой удаляют масло с фронтальной линзы объектива, отводят его в сторону и опус кают к предметному столику.
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Это достигается с помощью параболоид- или кардиоид-конденсора, который заменяет обычный конденсор в биологическом микроскопе.
Фазово-контрастная микроскопия. Основана на превращении изменений по фазе, возникающих при прохождении световой волны через так называемые фазовые (прозрачные) объекты, в изменения по амплитуде, которые улавливаются глазом. С помощью фазово-контрастного приспособления фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, превращаются в амплитудные и прозрачные объекты становятся видимыми в микроскоп. При этом они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негатив ным фазовым контрастом -- светлое изображение объекта на темном фоне.
Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-1 или КФ4.
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции. Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объекта, вторичная (наведенная) возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями -- флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследования живых микроорганизмов и обнаружения их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности.
В лабораторной практике люминесцентная микроскопия широко применяется для выявления и изучения многих микроорганизмов.
3. Типы микроскопических препаратов. Этапы приготовления фиксированного мазка. Простые методы окраски
В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов:
а) бактериологический мазок (препарат-мазок);
б) "висячая капля";
в) "придавленная капля";
г) тонкий мазок;
д)"толстая капля";
ж) препарат-отпечаток.
Этапы приготовления фиксированного мазка. Приготовление препаратов для микроскопического исследования.
Взятие материала для исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.
Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель -- в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой.
После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1--1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке.
Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур, м/озмов фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.
Простые методы окраски мазков: Фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1--2 мин) или метиленовым синим (3--5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют.
4. Дифференциально-диагностические методы окраски микробов. Окраска по Граму, механизм и техника окраски
Сложные методы. Включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому
составу и цвету, протрав и дифференцирующих веществ. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
1. По Леффлеру- гранулы валютина окрашиваются в темно- синий, а палочка дифтерийной каринобактерии в голубой.
2. По Нейсеру- валютин в сине-черный, а бактерия в желтый.
3. По Гинсу-Бурри- обнаружение капсул
4. По Шефферу- Фультону- окрашивание спор ( существует еще способ Пешкова).
5. Окраска по Цилю- Нельсену. Применяется для выявления кислото- и спиртоустойчивых микобактерий туберкулеза, лепры и некоторых актиномицетов, которые из-за большого количества в клеточных оболочках липилов, воска и оксикислот непроницаемы дл: разведенных растворов красителей.
Окрашивание их достигается, при помощи фенолового фуксина Циля с подогреванием над пламенем горелки до закипания и отхождения паров. Окрашенные с применением термокислотной обработки кислотоустойчивые бактерии не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта. Кислоустойчивые бактерии окрашиваются в интенсивно красный цвет, остальные виды микробов, обесцвечивающиеся в процессе обработки препарата кислотой, - в светло-синий цвет.
6. Окраска по Романовскому-Гимзе Осуществляется сложным красителем (в его состав входят метиленовый синий, эозин и азур), в результате он окрашивает бактерии (спирохеты), простейшие и форменные -элементы крови в различные цвета и оттенки. Так, под его воздействием цитоплазма простейших приобретает голубой цвет, а ядра - красный: боррелии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а трепонемы и лептоспиры - в слабо-розовый; эритроциты - в розовый цвет, ядра лейкоцитов - в фиолетовый, а их цитоплазма - в голубой (базофильная зернистость - в синий, эозинофильная - н красный, нейтрофильная - в сиреневый).
7. Окраска по Граму. Из-за неодинакового содержания пептидогликана (ПГ) в оболочках разных прокариот метод дает возможность подразделять их на грамположительные (фиолетовые, 90 % ПГ) и грамотрицательные (розовые, 5-20 % ПГ)
В соответствии с этим, во-первых, в царстве прокариот выделяют четыре раздела:
1. тонкостенные, грамотрицательные.
2. толстостенные, грамположительные.
3. лишенные стенок.
4. дефектные стенки, отсутствие пептидогликана.
Во-вторых, окраска по Граму позволяет также установить родовую и видовую принадлежность многих возбудителей инфекционных болезней. Например, известно, что все болезнетворные кокки (кроме гонококка и менингококка), бациллы и клостридии являются грамположительными. а энтеробактерии, вибрионы, трепонемы - грамотрицательными.
Техника окраски по Граму:
1) Наносим на фиксированный мазок через фильтровальную бумажку раствор генцианвиолетта на 2-3 минуты. У грам+ м/о генцианвиолет проникает вглубь клеточной стенки и образует прочный комплекс с трихоевыми кислотами и Mgниевыми солями РНК, у грам- краситель проникает в в клеточную стенку.
2) Промываем водой - для удаления излишков красителя
3) Наносим раствор Люголя на 1 минуту - для удаления остатков влаги и укрепления образовавшейся связи у грам+.
4) Сливаем, не промывая водой.
5) Наносим раствор этилового 96% спирта на 30 секунд, равномерно покачиваем для отхождения фиолетовых пятен. Из грам- вымывается краситель.
6) Промыть под водой
7) Наносим раствор фуксина на 2-3 минуты для окраски обесцветившихся грам- м/о
8) Промыть водой
-> грам- - красные, грам+ - синие.
5. Морфология бактерий. Отличия прокариотов от эукариотов. Основные формы бактерий
Пo форме клеток м/о собственно подразделяются на:
A) Шаровидные (кокки) правильной формы сферической или овальной формы:
а) микрококки располагаются беспорядочно.
б) диплококки - располагаются парами
в) стрептококки цепочки в виде пакетов из четырех кокков
г) тетракокки - располагаются в виде пакетов из четырёх кокков
д) сарцины - располагаются в виде пакетов из восьми кокков.
е) стафилококки - скопление кокков в форме виноградных гроздей.
Патогенные бактерии чаще всею представлены стафилококками, стрептококками, реже микрококками. Спор и жгутиков патогенные кокки не образуют.
Капсулы имеют лишь S.pneumoniae. Стафилококки и стрептококки - грамположительные, диплококки - грамотрицательные.
Б) Палочковидные бактерии цилиндрической формы, различаются по расположению, размерам, форме клеток и их концов.
а) в виде одиночных клеток
б) диплобактерии - располагаются парами
в) стрептобактерии - располагаются в виде цепочек