Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова
НАКОПЛЕНИЕ ТРЕГАЛОЗЫ У MYCOBACTERIUM SMEGMATIS mc2155 ПРИ РОСТЕ В СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ
А.С. Ильина, Н.С. Морозова, М.О. Шлеева
В последние годы много внимания уделяют возможной функции трегалозы как антистрессорного агента. Результаты исследований [1] говорят о том, что роль трегалозы как антистрессорного агента зависит от условий роста клеток. Четко прослеживается взаимосвязь между уровнем трегалозы и устойчивостью клеток к неблагоприятным условиям: избытку тепла, переохлаждению или недостатку влаги. Трегалоза для многих микроорганизмов является необходимым веществом, выполняющим роль осмопротектора, и позволяющим приспособиться к условиям недостатка влаги. Трегалоза накапливается как осмотически активный компонент в цианобактериях, в галофильной сульфат-восстанавливающей бактерии Desulfovibrio halophilus и некоторых других видах бактерий [2,3].
В микобактериях трегалоза в свободном виде встречается в относительно малых количествах. Она находится в клеточной стенке в виде гликолипида димиколата трегалозы, названного «корд фактор» и содержащего трегалозу, связанную с двумя остатками миколовых кислот. Трегалоза является предшественником и других неотъемлимых липидов клеточной стенки микобактерий: диацилтрегалозы, полиацилтрегалозы, сульфолипидов. За счет анаболизма этих липидов микобактериальные клетки способны адаптироваться к окислительному стрессу как in vitro, так и in vivo [4]. При этом многие виды микобактерий способны к переходу в «некультивируемое» (НК) состояние, с которым связывают латентную форму такого распространенного инфекционного заболевания, как туберкулез. И в настоящее время нет данных о тенденции синтеза трегалозы микобактериями при образовании НК форм. Поэтому целью данного исследования стало выявление трегалозы в клетках M. smegmatis и сравнение ее уровня в in vitro модели НК состояния c содержанием в клетках, не испытывающих стрессовых воздействий.
В качестве объектов исследования были выбраны клетки на начальном этапе роста (26 ч, КОЕ/мл~108) (рис.1), культивируемые в стандартных условиях (рост в среде Hartman's-de-Bont (H-dB)), а также в стрессовых условиях, приводящих к образованию НК форм (рост клеток M. smegmatis mc2155 в модифицированной среде Hartman's-de-Bont (mH-dB)). Главным отличием ростовой среды mH-dB от стандартной H-dB является отсутствие солей калия и наличие бычьего сывороточного альбумина (БСА), обладающей ограниченной связывающей способностью (~ 25%) по отношению к свободным жирным кислотам.
Рис. 1. Рост M. smegmatis в средах H-dB и mH-dB
Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием и высушили на роторном испарителе. Сухую биомассу экстрагировали дистиллированной водой в соотношении вода:биомасса 35:1 по массе в течение 4-х часов при температуре 95-97єС. Определение количества внутриклеточной трегалозы проводили с помощью тонкослойной хроматографии в системе 1-пропанол:этилацетат:вода 6:1:3 с визуализацией 10% серной кислотой в этиловом спирте с прожиганием и последующей обработкой хроматограмм с использованием компьютерной программы денситометр «Sorbfil».
Для подтверждения химической структуры экстрагируемого вещества оно было выделено при помощи колоночной хроматографии и проанализировано методом 1Н-ЯМР спектроскопии. В спектре присутствовали пики характерные для дисахарида трегалозы.
По данным, полученным в ходе работы, можно сделать вывод, что уровень трегалозы в клетках M. smegmatis, попадающих в неблагоприятные условия, выше в 2,7 раза по отношению к уровню в клетках, растущих в стандартных условиях уже на первые сутки роста (рис. 2). Полученный результат хорошо согласуется с данными, известными относительно других микроорганизмов и говорит о необходимости запасания трегалозы клетками микобактерий как вещества, позволяющего приспособиться к неблагоприятным условиям и образовывать формы, способные существовать в условиях стресса. трегалоза молекулярный дисахарид микобактериальный
Рис. 2. Уровень внутриклеточной трегалозы в активных и НК клетках M. smegmatis на 26 час роста, % от 1 клетки
Таким образом, впервые показано что в клетках M. smegmatis, испытывающих влияние неблагоприятных условий роста, приводящих к образованию НК форм, происходит накопление свободной трегалозы. Однако до сих пор остается открытым вопрос о молекулярных механизмах действия данного дисахарида в качестве антистрессорного агента.
Литература
1. Van Dijck P., Vizza D. C., Smet P., Thevelein J. M. Differential importance of trehalose in stress resistance in fermenting and nonfermenting Saccharomyces cerevisiae cells. // Applied and environmental microbiology. 1995. V. 61. P. 109-115
2. Arguelles J. C. Physiological roles of trehalose in bacteria and yeasts: a comparative analysis. // Arch Microbiol. 2000. V. 174. P. 217-224
3. Galinski E.A., Herzog R.M. The role of trehalose as a substitute for nitrogen-containing compatible solutes (Ectothiorhodospira halochloris). // Arch Microbiol. 1990. V. 153. P. 607-613
4. Singh A., Crossman D.K., Mai D. Mycobacterium tuberculosis WhiB3 maintains redox homeostasis by regulating virulence lipid anabolism to modulate macrophage response. // PLoS Pathogens. 2009. V. 8. P. 1 - 13