В результате взаимодействия между гормоном и специфичными к действию данного стимулятора рецепторами соответствующих клеток-мишеней в нормальных условиях in vivo происходят изменения в клеточном метаболизме: накапливаются метаболиты, расходуются вещества-предшественники, экскретируются в межклеточную среду специфические продукты метаболизма. Однако после извлечения тканей-мишеней из организма и ферментативного диспергирования изолированные клетки нередко теряют ряд специфических функциональных свойств, характерных для интактной ткани, и поэтому препараты иммобилизованных клеток не всегда способны продемонстрировать полную последовательность функциональных ответов, обычно возникающих при гормональной стимуляции исходной ткани. Тем не менее, во многих случаях степени дифференцировки, сохраняющейся в условиях in vitro, бывает достаточно, чтобы выбрать несколько специфичных, ярко выраженных ответов клеток, на основе которых можно разработать метод биотестирования данного гормона [4, c. 39].
При изучении различных метаболических ответов, а также при выборе оптимального метода измерений биологической активности (биотестирования) данного физиологически активного вещества следует оценивать каждый из ответов по следующим четырем критерием:
Специфичность ответа;
Чувствительность ответа;
Точность определения в выбранном интервале доз гормона;
Воспроизводимость ответа при использовании клеточных препаратов.
Более того, поскольку каждый метаболический ответ должен быть количественным, при объективной оценке ответов клетки на действие изучаемого гормона большое значение имеет простота и эффективность способов выделения каждого метаболита, а также характеристики методов его опреде-ленпя, таких как радиоиммунологический анализ или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Прежде всего необходимо изучить специфичность выбранного ответа клеток-мишеней на действие данного стимулятора. Не исключено, что действие других гормонов, особенно гормонов, имеющих сходную с исследуемым структуру, может вызывать подобный ответ. Например, такие гликопротеиновые гормоны, как лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), тиреотропный гормон (ТТГ) и хорионический гонадотропний гормон человека (ХГТЧ) имеют идентичные субъединицы и, как и предполагалось, обладают перекрестной активностью при взаимодействии с ТТГ-рецепторами. Однако в большинстве, случаев уровень функциональной перекрестной активности или простой блокировки рецепторов структурно сходными, но биологически неактивными молекулами можно свести до минимума, тщательно подбирая клетки-мишени и условия их инкубации, при которых достигается высокий уровень специфичности функционального ответа на действие исследуемого стимулятора [4, c. 45].
Следующий фактор, который необходимо принимать во внимание при оценке различных ответов иммобилизованных клеток-мишеней - это чувствительность ответа. Практически это означает, что следует установить минимальную дозу гормона, которую измеряют с помощью данного метода регистрации ответа клеток. Чувствительность ответа определяют как наименьшее количество стимулятора, которое удается отличить от нулевой дозы при заданных условиях биотеста; его находят, построив для исследуемого гормона кривую доза - ответ.
Можно установить, как влияют на чувствительность биотеста изменения условий инкубации, таких как плотность клеток-мишеней в монослое, время действия стимулятора, ионная сила и pH среды, а также выбрать условия, в которых чувствительность проводимого биотеста максимальна. Точность измерения действия гормона, или показатель эффективности анализа, определяют по графикам зависимости точности измерения от дозы гормона. Эти графики можно использовать для сравнения эффективности биотеста в различных интервалах доз исследуемого гормона, т. е. на различных участках стандартной кривой, а также для изучения влияния различных условий инкубации или каких-либо веществ на эффективность биотеста в любом заданном интервале доз гормона. При оптимизации условий проведения биотеста следует стараться подобрать условия для наиболее точного определения действия гормона, по крайней мере, в интересующем, а желательно в максимально широком интервале доз. Подобный метод анализа кривой доза - ответ первоначально использовали для анализа кривых насыщения. Аналогичный, хотя и немного упрощенный, подход был затем применен для оптимизации и оценки методов биотестирования стимуляторов щитовидной железы, основанных на ответах in vitro срезов ткани щитовидной железы и клеточных мембран или первичной культуры клеток щитовидной железы в монослое [7, c. 21].
Заключение
Ограниченность использования иммобилизованных животных клеток в значительной мере была обусловлена трудностью их культивирования. За последние годы достигнуты большие успехи в разработке методов контролируемого культивирования in vitro млекопитающих. Можно выделить несколько факторов, которые способствовали быстрому развитию этой области биотехнологии, а именно: 1) получение непрерывных, полностью охарактеризованных клеточных линий; 2) обнаружение специфических факторов роста; 3) разработка аппаратуры для культивирования изолированных клеток в оптимальных условиях [5, c. 107].
Быстрое развитие методологии культивирования клеток оказало огромное влияние на научные исследования во многих областях биологии. Постоянно упрощаются и совершенствуются в частности, методики выделения и изучения продуктов клеточного метаболизма, таких как гормоны, ферменты и антитела. Иммобилизованные поверхностно-активные клетки тканей животных играют все большую роль во многих областях биологии. Иммобилизованные клетки обычно сохраняют высокую степень функциональной дифференцировки, что облегчает изучение регуляции клеточного метаболизма гормонами и ростовыми факторами, а также способствует изучению механизмов модификации клеточных функций под действием различных эффекторов, например, лекарственных препаратов и токсинов. Так, иммобилизованные гепатоциты нашли широкое применение в исследованиях метаболизма чужеродных веществ в печени [5, c. 108].
Список использованных источников
1. Юрин, В.М. Иммобилизованные клетки и ферменты: курс лекций / В.М. Юрин. - Минск: БГУ, 2006. - 138 с.
2. Жебентяев, А.И. Электрохимические методы анализа: учебное пособие / А.И. Жебентяев, А.К. Жерносек, И.Е. Талуть. - Витебск: ВГМУ, 2016. - 106 с.
3. Короткова, Е.И. Физико-химические методы исследования и анализа: учебное пособие / Е.И. Короткова, Т.М. Гиндуллина, Н.М. Дубова. - Томск: Изд-во Томского политехнического университета, 2011. - 168 с.
4. Кудряшов, А.П. Биосенсорные устройства: курс лекций / А.П. Кудряшов. - Мн: БГУ, 2003. - 113 с.
5. Семак, И.В. Инженерная энзимология: курс лекций / И.В. Семак. - Минск: БГУ, 2006. - 125 с.
6. Суслова, А.И. Основные понятия биохимии. Ферменты: учебное пособие / А.И. Суслова, В.И. Бахтаирова. - Иркутск: ИГМУ, 2014. - 41 с.
7. Никольский, Б.П. Ионоселективные электроды / Б.П. Никольский, Е.А. Матерова. - Л.: Издательство «Химия», 1980. - 240 с.
8. Баталова, Т.А. Ферментные электроды: учебное пособие / Т.А. Баталова. - Благовещенск: ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия», 2008. - 16 c.