Статья по теме:
Распространение антибиотикорезистентности в почве при ее обработке компостами, содержащими окситетрациклин и гены устойчивости к нему
Н.В. Данилова, П.А. Курынцева, М.Ш. Тагиров, П.Ю. Галицкая, С.Ю. Селивановская, Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, 420008, Россия 2Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства ФИЦ Казанский научный центр РАН, г. Казань, 420059, Россия
Аннотация
Вследствие активного применения антибактериальных препаратов в животноводстве остатки антибиотиков и гены устойчивости к ним поступают в почвы при ее удобрении навозами и компостами. В работе оценивали поступление генов антибиотикорезистентности в почву при ее удобрении компостами, содержащими окситетрациклин (ОТС) и гены устойчивости к тетрациклинам. Для этого были исследованы следующие смеси в течение 35 сут: а) почва, обработанная чистым компостом, б) почва, обработанная компостом, содержащим 300 мг/кг ОТС, в) почва, обработанная компостом, содержащим гены антибиотикорезистентности. В почве после обработки компостами увеличилось количество бактерий и грибов, причем наибольшие изменения численности бактерий отмечены для почвы, обработанной компостом с ОТС. Внесение в почву компостов с антибиотиком и генами устойчивости /е/(М) и е(Х) привело к формированию у почвенных микроорганизмов антибиотикорезистентности с наибольшим количеством копий генов на 5-7-е сутки: в среднем 3.31 *Ш6 и 7.77-106 копий/г соответственно. Оба гена, е(М) и 1ефХ), но в меньшем количестве, были выявлены в почве с чистым компостом на 14-21-е сутки.
Ключевые слова: антибиотики, окситетрациклин, антибиотикорезистентность, гены устойчивости, компост, ПЦР в реальном времени
Введение
ген антибиотикорезистентность компост микроорганизм
Антибактериальные препараты активно используют в сельском хозяйстве для выращивания животных. Их применяют не только для профилактики и лечения бактериальных инфекций, но и для ускорения набора массы молодняка [1-4]. Среди многообразия групп антибиотиков наиболее интенсивно фермерами применяются тетрациклины: тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин [4, 5].
В связи со слабой адсорбцией в организме животных до 90% исходной дозы антибиотика выводится в окружающую среду в составе экскрементов [3, 5-9]. Согласно ряду исследований в навозе сельскохозяйственных животных обнаруживают остатки антибиотиков в концентрациях до нескольких сотен мг/кг [10].
Помимо самих антибиотиков навоз животных содержит устойчивую к антибиотикам кишечную микрофлору.
Применение навоза для восстановления и повышения плодородия пахотных угодий является широко распространенной практикой в сельском хозяйстве, поэтому существует риск попадания остатков антибиотиков и микроорганизмов, обладающих резистентностью к ним, в почвенные экосистемы [3, 11]. Имеются различные сведения об эффективности компостирования для очищения навоза от антибактериальных препаратов и генов устойчивости к ним. Так, во многих исследованиях приводятся данные, согласно которым компостирование навоза ввиду высоких температур во время процесса представляется эффективным способом, позволяющим значительно снизить содержание антибиотиков и генов устойчивости к ним в исходном навозе [12-14]. Вместе с этим следует отметить, что удобрение сельскохозяйственных угодий навозами, не подвергшимися компостированию, или незрелыми компостами создает потенциальный риск распространения остатков антибиотиков и генов устойчивости в почвы. Кроме того, во время термофильной фазы компостирования высокая температура может интенсифицировать горизонтальный перенос антибиотикорезистентности [15]. Антибиотики в составе навозов и компостов могут привести к нарушениям в круговороте питательных элементов, необходимых сельскохозяйственным растениям, вследствие изменения структуры и функционирования микробного сообщества почвы. Кроме того, распространение генов антибиотикоустойчивости от бактерий, населяющих компосты, к почвенным бактериям и их аккумуляция в растениях могут стать потенциальным риском их попадания в организм человека по пищевой цепи [3].
В настоящей работе оценивали присутствие генов устойчивости к тетрациклинам 1е1(Х) и 1е1(М) у микроорганизмов почвы при удобрении компостами, содержащими окситетрациклин (ОТС) и гены антибиотикорезистентности.
Экспериментальная часть
Компост был приготовлен на основе коровьего навоза, отобранного на частной ферме (Лаишевский район, Республика Татарстан). В исходный навоз был добавлен препарат ОТС в концентрации 150 мг/кг. ОТС был выбран в качестве модельного антибиотика, поскольку он является распространенным и эффективным препаратом при лечении инфекционных заболеваний животных в Российской Федерации. Компостирование осуществляли в течение 4 месяцев при температуре 20-25 °С. В процессе компостирования содержание генов устойчивости к тетрациклинам 1е1(Х) и 1е1(М) достигало 3.99-108 копий/г, но их количество постепенно снижалось. По окончании процесса компостирования генов tet(X) и методом ПЦР в реальном времени обнаружено не было.
Полученный компост был разделен на три части. Первая часть представляла собой исходный компост (К), во вторую часть компоста был добавлен ОТС концентрацией 300 мг/кг (К+ОТС). В третью часть компоста для формирования антибиотикорезистентности у микроорганизмов добавлялся ОТС концентрацией 300 мг/кг 3 раза с периодичностью 2 недели. В итоге через 6 недель содержание генов устойчивости в компосте составило 8.59-106 копий /г для 1е1(М) и 3.03 * 107 копий /г для tet(X) (К+АРГ), в то время как сам препарат ОТС полностью разложился.
Компост был добавлен в почву в дозе 0.8%, что соответствует 20 т/га. В результате были получены следующие смеси: почва (П), почва с чистым компостом (П+К), почва с компостом и ОТС (П+К+ОТС), почва с компостом и антибиотикорезистентными генами (П+К+АРГ). Почва для исследования отобрана на территории Лаишевского района Республики Татарстан с глубины 0-20 см, тип - серая лесная. Отбирали почву методом конверта с глубины 0-20 см. По 4 кг почвы было помещено в лабораторные пластиковые контейнеры. В качестве контрольного образца использовалась почва без компоста. Опыт проводили в трех независимых повторностях.
Смеси почвы и компоста инкубировали 35 сут в лабораторных условиях при температуре 20-25 °С и относительной влажности 60%.
Содержание ОТС в почве оценивали методом жидкостной хроматографии на приборе Agilent 1200 LC/MS System (Agilent, США). ОТС экстрагировали согласно методике, описанной в работе [16]. Детекцию антибиотика проводили с использованием колонки Zorbax SB C18 с УФ -детектором (длина волны 365 и 265 нм). В качестве мобильной фазы А была использована вода, в качестве мобильной фазы В - ацетонитрил. Концентрацию антибиотика рассчитывали методом внешнего стандарта по площади пика ионов [16].
Выделение тотальной ДНК из образцов почвы массой 0,3 г производили с использованием набора Fast DNA Spin Kit For Soil (MP Bio, Германия). Для очищения ДНК применяли QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen, Германия).
Численность бактериальных и грибных штаммов анализировали методом ПЦР в реальном времени [17] с использованием двух пар праймеров: 947f/1349r для бактерий (f: AACGCGAAGAACCTTAC, r: CGGTGTGTACAAGGCCCGGG AACG) и ITS1f/ITS2r (f: TCCGTAGGTGAACCTGCGG, r: GCTGCGTT CTTCA TCGATGC) для микроскопических грибов в амплификаторе BioRad CFX-96 cycler (BioRad, Германия). Для амплификации использовали следующую программу: первичная денатурация при 95 °С в течение 5 мин, далее 39 трехступенчатых циклов при 62-60 °C в течение 45 с, при 95 °C в течение 15 с и при 72 °C в течение 30 с. Рабочий раствор для амплификации имел следующий состав (25 мкл): матричная ДНК - 1 мкл, праймеры (10 мкМоль) - по 0.5 мкл, dNTP (10 мМоль) - 2.5 мкл, Taq Buffer (10*) - 2.5 мкл, MgCl2 (25 мМоль) - 2.5 мкл, Taq polymerase (5 ед./мкл) - 0.2 мкл и ddH2O - 15.3 мкл. Для построения калибровочных кривых использовали бактерию Pseudomonas putida и микромицет Pйnicillium notatum.
Оценка наличия антибиотикорезистентных генов tet(M) и tet(X) в почве после ее удобрения компостами проводилась с помощью метода ПЦР в реальном времени [18]. Клонирование генов tet(M) и tet(X) осуществляли с помощью TA Cloning Kit (Invitrogen Corporation, США). Плазмиды с генами tet(M) и tet(X) экстрагировали с использованием PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen Corporation, США). Для реакции ПЦР в реальном времени использовали следующие специфические праймеры: tet(M) (f:GGTTGGAATGTGACGGACTG, r:ATCGTTGTATGCTCGTGAAAGA), tet(X) (fGAAAGAGACAACGACCGAGAG, r:ACACCCATTGGTAAGGCTAAG). Реакционная смесь (25 мкл) содержала следующие компоненты: матричная ДНК - 1 мкл, праймеры (10 мкМоль) - по 0.5 мкл, dNTP (10 мМоль) - 2.5 мкл, Taq Buffer (10*) - 2.5 мкл, MgCl2 (25 мМоль) - 2.5 мкл, Taq polymerase (5 ед./мкл) - 0.2 мкл и ddH2O - 15.3 мкл. Амплификацию проводили в термоциклере BioRadCFX -96 cycler (BioRad, Германия) по следующей программе: предварительная денатурация - 3 мин при 94 °C; 39 циклов: денатурация - 45 с при 94 °C, отжиг - 45 с при 55 °C, элонгация - 45 с при 72 °C.
Результаты и их обсуждение
При оценке численности бактерий и грибов методом ПЦР в реальном времени было выявлено, что внесение в почву, как чистого компоста, так и компостов, содержащих антибиотик и гены устойчивости, изменяет количество бактериальных и грибных штаммов (рис. 1). В контрольной почве в течение всего эксперимента их количество было значительно ниже и составило в среднем 2.24-106 и 3.25* 104 копий генов/г соответственно. В ряде исследований также указывается, что в почве после обработки компостом численность бактерий и грибов увеличивается по сравнению с исходной [19-21].
В почве с чистым компостом (образец П+К) количество бактериальных штаммов находилось примерно на одном уровне - в среднем 7.30306 копий/г; в количестве грибных штаммов наблюдался небольшой спад на 3 -е сутки (в 1.42 раза по сравнению с 1-ми сутками). Значительных колебаний в численности бактерий и микроскопических грибов в данном образце П+К обнаружено не было, что, скорее всего, связано с отсутствием в исходном компосте токсичных для них соединений.
Более значительные колебания численности бактерий были отмечены в образцах П+К+ОТС и П+К+АРГ. Так, на 1-е и 3-е сутки численность бактерий в образце П+К+ОТС была ниже, чем в других смесях почвы с компостом, и составила 4.85* 106 копий генов/г. На 5-е сутки был зафиксирован резкий рост в их количестве - 1.50-107 копий генов/г, что в 3.43 раза больше, чем на 3-е сутки. Такая высокая численность бактерий держалась до 21 суток. На 28-35-е сутки количество генов бактерий снизилось и составило в среднем 1.13-107 копий/г, однако оно значительно превышало таковое в остальных образцах. Описанное снижение численности бактерий на 1-3-е сутки может быть связано с ингибированием чувствительных к антибиотику бактерий, а последующее резкое увеличение - с активным размножением устойчивых видов [3].
В образце П+К+АРГ произошел рост численности бактерий на 3-7-е сутки в 1.76 раза в сравнении с 1-ми сутками. Далее наблюдалось плавное снижение количества копий бактериальных генов, которое на 35-е сутки составило 5.95-106 копий/г. Вероятно, увеличение количества бактерий связано, как и в образце П+К+ОТС, с размножением видов, выработавших механизмы устойчивости к ОТС, который был внесен в исходный компост для формирования антибиотикорезистентности.
Рис. 1 - Количество бактерий (а) и грибов (б) в смесях почвы и компоста, содержащего ОТС и гены устойчивости к тетрациклина
Как и в случае бактерий, численность грибов в контрольной почве оказалась ниже, чем в почве, обработанной компостом, содержащим антибиотик, и компостом, содержащим гены устойчивости, что связано с более богатым по численности составом микробного сообщества компостов. В остальных образцах почвы и компоста наблюдались колебания численности грибов во времени, однако значимых различий между образцами обнаружено не было.
Соотношение численности бактерий и грибов, представленное на рис. 2, более ярко демонстрирует описанные тенденции: так, в чистой почве наблюдался постоянный уровень их соотношения. В почве с чистым компостом (образец П+К) соотношение бактерии/грибы было больше, чем в почве без компоста, особенно на 3-е стуки, поскольку для компоста характерно другое по соотношению микробное сообщество [22]. В образце П+К+АРГ на 3-14-е сутки соотношение бактерии и грибов значительно превышает таковое в почве с чистым компостом, так как вероятно для бактерий-носителей антибиотикорезистентности в чистой почве более благоприятные условия [23]. В образце П+К+ОТС на 1-е и 3-е сутки соотношение бактерий и грибов находится в пределах уровня контрольного образца, так как антибиотик, вероятно, оказывал прямое токсическое воздействие [6]. Далее это соотношение значительно увеличилось в результате приспособления к антибиотику видов с генами устойчивости, которые заняли экологическую нишу [24]. В целом для всех образцов почвы с компостом в соотношении численности бактерий и грибов отмечалось плавное снижение к 35-м суткам вследствие стабилизации микробного сообщества.
Рис. 2 - Соотношение численности бактерий и грибов в смесях почвы и компоста, содержащего ОТС и гены устойчивости к тетрациклинам
Рис. 3 - Содержание генов устойчивости к тетрациклинам 1е1(М) (а) и Щ1(Х) (б) в смесях почвы и компоста, содержащего ОТС и гены устойчивости к тетрациклинам
Результаты скрининга на присутствие генов антибиотикорезистентности в почве представлены на рис. 3. Было обнаружено, что контрольная почва не содержала устойчивые к тетрациклинам гены. Внесение в почву компоста, содержащего препарат ОТС, и компоста, содержащего гены устойчивости Є(М) и Є(Х), привело к формированию антибиотикорезистентности у почвенных микроорганизмов, что подтверждается литературными данными [25-27]. Гены устойчивости Є(М) и Є(Х) были обнаружены в этих образцах начиная с 1-х суток эксперимента. Более низкий уровень содержания генов Є(М) и Є(Х) в смеси почвы и компоста с ОТС на 1 -е сутки, вероятно, связан с тем, что бактерии не сразу выработали механизмы устойчивости против ОТС. Наибольшее количество генов устойчивости отмечено на 5-7-е сутки: в образце П+К+АРГ количество генов Є(М) и Є(Х) составило в среднем 3.31 * 106 и 7.77-106 копий/г, в образце П+К+ОТС - 4.48* 106 и 9.10-106 копий/г соответственно. Увеличение содержания генов устойчивости на 5-е сутки может быть результатом интенсификации горизонтального переноса между бактериями компоста и почвенными бактериями [27].