Магистерская работа: Сравнительное исследование микробных сообществ щелочных слабоминерализованных гидротерм Байкальской рифтовой зоны и щелочных минерализованных гидротерм озера Моно-Лейк на острове Паоха

Таким образом, впервые была показана способность бродильных алкалитермофильных анаэробных бактерий активно восстанавливать соединения железа и селена.

.4.3 Генотипические свойства и филогенетическое положение

Результаты анализа сиквенса 16S рРНК (1527 нуклеотидов) штамма Paoha-1 показали, что штамм принадлежат к группе Clostridium/Bacillus грам-положительных бактерий, роду Anaerobranca. Коэффициенты сходства сиквенсов штамма Paoha-1 и других представителей рода Anaerobranca составили 98.4 - 98.8% с A. horikoshii и 97.0-97.2% с A. gottschalkii. На филогенетической дендрограмме показано эволюционное положение штамма Paoha-1 по отношению к близкородственным бактериям.

Результаты анализа нуклеотидного состава ДНК показали, что содержание ГЦ пар в ДНК штамма Paoha-1 составляло 30.3 мол%, что было очень близким к A. gottschalkii (30.9 мол%), и отличалось от A. horikoshii (33 - 34.3 мол%) (таб 20).

Результаты ДНК-ДНК гибридизации выявили низкий процент гомологии ДНК для штамма Paoha-1 и типовых штаммов A. gottschalkii (38%) и A. horikoshii (29%), что свидетельствует о его таксономической обособленности от этих видов. Уровень гомологии ДНК между типовыми штаммами A. horikoshii и A. gottschalkii по нашим данным составляет 51%.

По совокупности фенотипических и генотипических признаков штамм Paoha-1 является новым видом рода Anaerobranca. В таблице 20 приведены различительные признаки видов данного рода.

Основными свойствами различающимися у трех видов рода Anaerobranca являются: свойства клеточной стенки, отношение к солености, способность с сбраживанию глюкозы, способность использовать фумарат как акцептор электронов. На основании проведенных исследований мы предлагаем отнести выделенный штамм к новому виду бактерий под названием "Anaerobranca californiensis".

.4.4 Диагноз вида Anaerobranca californiensis

Ca.li.for.ni.en.sis - из Калифорнии. Клетки представляют собой прямые палочки, иногда ветвящиеся. Размер клеток 0.26-0.31*2.4-5.0 мкм. При росте на твердой среде образует колонии 3-5 мм в диаметре, серого цвета. Клеточная стенка тонкая, Грам-положительная, наружная мембрана отсутствует, хотя клетки окрашиваются как Грам-отрицательные. Облигатный анаэроб. Температурный диапазон роста 45-70°C, оптимум 58°C. Диапазон рН 8.6-10.4, оптимум pH 9.0 - 9.5. Рост происходит в диапазоне от 0 до 6% NaCl с оптимумом при 1-2.5%.

Микроорганизм способен расти гетеротрофно на различных субстратах, наилучший рост наблюдается на пептоне, триптоне, соетоне, гидролизате казеина, дрожжевом экстракте.

Способен к медленному росту на фруктозе, сахарозе, мальтозе, крахмале, гликогене, декстрозе, целлобиозе и глицерине в присутствии дрожжевого экстракта (0.01%) как фактора роста. Гликоген, глюкозу и целлюлозу не использует. Пируват используется, но ацетат и лактат не поддерживают рост.

Диссимиляторная редукция фумарата, сульфата, сульфита и нитрата не обнаружена.

Способен восстанавливать полисульфид и элементную серу до сульфида. Обладает высокой толерантностью к сульфиду (до 40 мМ). В присутствии тиосульфата (20 мМ) образует сульфид в количестве 10 мМ. Также способен восстанавливать цитрат железа (III), гидроокись железа (III), селенат натрия (Se(VI)).

Выделен из щелочного термального источника (pH 9.7, минерализация 25 г/л, температура 90°C) расположенного на озере Моно Лейк, остров Паоха (Калифорния, США).

Содержание ГЦ составляет 30.3%. Уровень ДНК-ДНК гибридизации с типовым штаммом A. horikoshii составляет 38%, с типовым штаммом A. gottschalkii - 29%. Типовой штамм Paoha-1 депонирован в Немецкой коллекции микробных культур (DSMZ) под номером 14826, в коллекции ИНМИ РАН под номером Uniqem-229. Номер в ГенБанк AY064217.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Главным физико-химическим фактором среды, оказывающим влияние на состав и распространение микробных сообществ в гидротермах, является температура (Горленко и др., 1985, Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989; Brock, 1967). С уменьшением температуры по изливу исследованных нами источников разнообразие микроорганизмов расширяется.

В щелочных гидротермах микробные сообщества кроме высокой температуры подвергаются комбинированному воздействию и других экстремальных факторов: высокого рН и, в ряде случаев, высокого содержания сульфида и минерализации. В исследованных гидротермах фототрофные сообщества появляются при более низкой температуре чем в слабощелочных и нейтральных гидротермах. Для сравнения, в Уринском источнике с рН 8.8 цианобактериальный мат начинается с температуры 64°С, тогда как в слабощелочном Октопус спринг с 73°С (Brock, 1967). При этом, наблюдается обратная зависимость между верхним температурным пределом распространения микробного мата и содержанием сульфида в источнике (рис. 27). Чем выше содержание сульфида, тем ниже максимальная температура распространения микробного мата по изливу источника. Также было обнаружено, что термофильная цианобактерия Mastigocladus laminosus, широко распространенная в нейтральных гидротермах, практически не встречается в микробных матах щелочных источников. Вместо нее в широком диапазоне условий среды доминируют цианобактерии Phormidium spp. и Anabaena spp., являющиеся более толерантными к высоким значениям рН.

Важной особенностью щелочных гидротерм является доминирование цианобактерий в составе микробных матов при содержании сульфида в воде более 1 мг/л. Ранее считалось, что при такой концентрации сульфида в составе микробного мата обязательно доминируют аноксигенные фототрофные бактерии (АФБ) (Castenholz, 1976, 1977; Ward et al., 1989). Наши исследования показали, что это правило не может быть применено к щелочным гидротермам. Так, на диаграмме рН-Т, построенной с помощью литературных и собственных данных, указаны области распространения различных типов сообществ при содержании сульфида более 1 мг/л (рис. 28). АФБ доминируют в слабокислых и нейтральных условиях, но в щелочных условиях, как было показано нами, доминируют цианобактерии.

Это явление может быть объяснено снижением токсичности сероводорода при повышении рН (Заварзин, 1972; Howsley, Pearson, 1979). На диаграмме рН-S^2- показано, как происходит последовательная смена типов сообществ с повышением рН в сульфидсодержащих гидротермах при температуре около 60°С (рис. 29). При рН менее 7 большинство молекул сероводорода находится в недиссоциированном состоянии и способно легко проникать через клеточную стенку. В составе сообщества доминирует Chloroflexus aurantiacus. При рН более 7 начинает доминировать менее токсичный гидросульфид-ион, и в составе микробного мата появляются цианобактерии. Они располагаются под слоем Chloroflexus aurantiacus, который защищает цианобактерии от воздействия высоких концентраций растворенного в воде сульфида. При рН более 8.5 весь сероводород переходит в гидросульфид-ион и, как было показано нами, в составе мата доминируют цианобактерии. Сравнение оптимумов рН цианобактерий, АФБ и хемотрофных бактерий выделенных из Большереченского источника указывает на то, что доминирующие в микробном мате цианобактерии более приспособлены к высоким рН, чем АФБ. Цианобактерии, подщелачивающие среду в ходе оксигенного фотосинтеза являются алкалофилами, тогда как АФБ и хемотрофные бактерии являются нейтрофилами и алкалотолерантами (рис. 13).

Нами был обнаружен аноксигенный мат с доминированием Chloroflexus aurantiacus в Аллинском источнике, но необходимо учитывать, что его развитие происходило в области смешения сульфидсодержащих щелочных термальных вод с рН 9.0-9.9 и речных вод с рН 8.3, что опять же подтверждает предположение о контроле распространения микробных сообществ различными формами сульфида. Повышение устойчивости гидросульфид-иона при щелочной реакции среды также может быть причиной отсутствия массового развития термофильных серобактерий при температуре около 70°С.

Минерализация также является фактором среды, ограничивающим распространение микробных матов и оказывающим влияние на видовой состав сообщества. В минерализованном источнике Паоха комбинированное воздействие факторов среды исключает развитие термофильного цианобактериального мата и термофильной АФБ Chloroflexus aurantiacus. Цианобактериальный мат обнаружен при температурах ниже 47°С и доминируют в нем цианобактерии родов Phormidium, Oscillatoria и мезофильная галоалкалофильная пурпурная бактерия Ectothiorhodospira shaposhnikovii.

Микробные сообщества щелочных гидротерм обладают высокой продуктивностью, сравнимой с другими высокопродуктивными экосистемами. Максимальное содержание хлорофилла а составляет 892 мг/м². Скорость оксигенного фотосинтеза достигает 3.5 гС/м² сут, что сравнимо со скоростями оксигенного фотосинтеза в источниках Термофильный (2.3 гС/м² сут) и Октопус Спринг (4 гС/м² сут). Скорость аноксигенного фотосинтеза достигает высоких значений в микробных матах источников (5.5 гС/м² сут) несмотря на то, что в составе микробных матов доминируют цианобактерии. Это может быть объяснено переключением цианобактерий на аноксигенный фотосинтез. Максимальная скорость темновой фиксации - 12.1 гС/м² сут. Максимальная суммарная продукция достигает 21 гС/м² сут.

Комбинированное воздействие высокой температуры, рН и сульфида оказывает влияние и на активность биогеохимических процессов по изливу источников. В источниках Гаргинский, Сеюйский и Уринский с невысокими содержаниями сульфида продуктивность микробных матов очень высока, а оптимум продукционных процессов находится при температуре 45-50°С. Тогда как в Большереченском источнике с высоким содержанием сульфида и наиболее высокими значениями рН наибольшая продуктивность наблюдается при температурах 33-39°С, а значения продуктивности уступают значениям обнаруженным в бессульфидных источниках.

Процессы терминальной деструкции также обладают высокой интенсивностью. Максимальное значение сульфатредукции достигает 5.5 tS/м² сут. Скорость метаногенеза невысока, до 1.5 мгС/м² сут. Соответственно, через процесс сульфтаредукции расходуется на 2-3 порядка больше органического вещества, что обуславливается высоким содержанием сульфата в термальных водах.

Высокая интенсивность процесса сульфатредукции приводит к тому, что даже если в водах отсутствует растворенный сульфид, то все равно создаются условия для активной деятельности микроорганизмов цикла серы. Аноксигенные фототрофные бактерии, участвующие в данном цикле, достигают высокой численности в микробных матах щелочных источников (до 10⁷ кл/мл).

Термофильная алкалотолерантная АФБ Chloroflexus aurantiacus достигает значительной численности в микробных матах слабоминерализованных щелочных гидротерм. В отдельных случаях этот организм даже доминирует в мате. Нами было выделено 10 штаммов Chloroflexus aurantiacus из различных источников. ДНК-ДНК гибридизация с известным штаммом OK-70fl показала, что все они принадлежат к одному виду. Тем не менее, ряд их свойств (температурный оптимум, отношение к кислороду) отличается друг от друга, что свидетельствует о приспособленности штаммов к условиям местообитаний в различных источниках.

Исследованные культуры способны к фотоавтотрофному росту, используя сульфид в качестве донора электронов, но лучше растут в фотогетеротрофных условиях. Кроме того большинство штаммов Chloroflexus aurantiacus хорошо растут в присутствии органических субстратов в аэробных или микроаэробных условиях. Наиболее вероятно они выполняют в сообществе функцию первичного деструктора.

Ранее было показано, что наряду с сульфидом, восстановленное железо может служить донором электронов при аноксигенном фотосинтезе у некоторых мезофильных АФБ (Widdel et al., 1993; Ehrenreich et al., 1994). Наши исследования показали, что изученные штаммы Chloroflexus aurantiacus не способны к фотоавтотрофному росту на восстановленном железе. Но зато в ходе аэробного темнового гетеротрофного роста вокруг нитей образовывались толстые чехлы из окисленного железа. Это может являться одним из механизмов образования ожелезненных микрофоссилий в древних породах, сформированных цианобактериальным матами, в которых кислород поступал в результате оксигенного фотосинтеза.

В щелочных водах миграция катионогенных элементов, в первую очередь железа, затруднена, поэтому обнаружение у выделенной нами термофильной алкалофильной бактерии Anaerobranca californiensis способности к восстановлению железа представляет большой интерес. Данная способность может быть обусловлена эволюционно. Нами также было показано, что и другие алкалофильные представители рода Anaerobranca тоже обладают способностью к железоредукции.

Участие микробного сообщества в карбонатном минералообразовании изучалось на примере Гаргинского источника. В воде источника натрий доминирует над кальцием, сульфат-ион доминирует над гидрокарбонат-ионом, а также содержится значительные концентрации растворенной кремнекислоты, поэтому факт образования из таких вод карбонатно-кальциевого травертина представляет значительный интерес (Борисенко и др., 1976). Образование травертина не могло происходить в ходе декомпрессии углекислого газа при выходе на поверхность, так как содержания в воде источника углекислого газа, карбоната, гидрокарбоната и кальция слишком низки (Плюснин и др., 2000). Образование травертина наиболее активно происходит в зоне развития микробного мата и, по нашим наблюдениям, тесно связано с его состоянием. Наибольшая активность процесса обнаруживается в зонах с постоянным доступом воды источника и превышением продукции над деструкцией (зоны I, II, III). Здесь происходит формирование щелочного геохимического барьера в ходе оксигенного фотосинтеза в цианобактериальном мате, на котором и происходит осаждение карбоната кальция. Таким образом, микробное сообщество играет ведущую роль в травертинообразовании в Гаргинском источнике.

Сравнение нейтральных углекислых источников (рис. 30) с высоким содержанием кальция и карбонатов, и сульфатно-натриевого Гаргинского источника, с низким содержанием кальция и карбонатов, показывает, что микробное сообщество играет ведущую роль в травертинообразовании в Гаргинском источнике, формируя щелочной барьер, на котором происходит осаждение карбоната кальция. При рН выше 8.4 образования травертина не происходит в связи с отсутствием кальция. В этой области происходит образование кремневых корок типа гейзерита около выходов источников, наблюдавшееся нами на Большереченском, Аллинском и Уринском источниках.

Образцы высохшего микробного мата, поверхности травертина и керна травертина Гаргинского источника были исследованы нами с применением электронной микроскопии. В них были обнаружены современные микрофоссилии (МФ) в виде сфер и нитей. Наибольшее количество МФ было обнаружено в высохшем мате. С увеличением глубины в травертине количество микрофоссилий уменьшается в ходе диагенеза.

1. Высокие значения рН, температуры и содержания сульфида ограничивают распространение фототрофных микробных матов, которые в щелочных гидротермах развиваются при более низкой температуре, чем в нейтральных.

2. Особенностью щелочных сульфидсодержащих гидротерм, в отличие от нейтральных гидротерм, является отсутствие образования аноксигенных микробных матов. В составе микробных матов щелочных гидротерм доминируют алкалофильные цианобактерии Phormidium spp.

3. Микробные сообщества пресных и минерализованных щелочных гидротерм отличаются по видовому составу. Термофильная аноксигенная фототрофная бактерия Chloroflexus aurantiacus достигает значительной численности в микробных матах пресных щелочных гидротерм, но отсутствует в минерализованных щелочных гидротермах. В составе сообщества минерализованных гидротерм значительной численности достигает галоалкалофильная аноксигенная фототрофная бактерия Ectothiorhodospira shaposhnikovii.

4.   Продуктивность микробных сообществ щелочных гидротерм сравнима с продуктивностью нейтральных гидротерм. Наиболее продуктивными являются сообщества, развивающиеся в температурном диапазоне 35-50°С. Доминирующим процессом терминальной деструкции является сульфатредукция, роль метаногенеза в деструкции органического вещества незначительна.

5.   Показана экофизиологическая приспособленность термофильной аноксигенной фототрофной бактерии Chloroflexus aurantiacus к условиям местообитаний в различных источниках и их экологических зонах.

6.   Показано, что чистые культуры аноксигенной фототрофной бактерии Chloroflexus aurantiacus могут откладывать окисное железо на поверхности клетки в ходе аэробного темнового роста. Восстановленное железо не является донором электронов для фотоавтотрофного роста у исследованных штаммов.

7.   Выделен новый вид алкалотермофильной бактерии с бродильным метаболизмом Anaerobranca californiensis, способной к неспецифическому восстановлению широкого ряда неорганических соединений: тиосульфата, элементной серы, полисульфида, железа, селена.