Магистерская работа: Сравнительное исследование микробных сообществ щелочных слабоминерализованных гидротерм Байкальской рифтовой зоны и щелочных минерализованных гидротерм озера Моно-Лейк на острове Паоха

Образцы высохшего микробного мата, поверхности травертина и керна травертина Гаргинского источника были исследованы нами с применением электронной микроскопии. Образцы керна были любезно предоставлены А. М. Плюсниным. В образцах травертина и микробного мата были обнаружены современные микрофоссилии (МФ) в виде нитей и сфер (рис. 16). Среди останков нитей доминируют образцы диаметром от 2.5 мкм до 4.5 мкм (30 единиц, 60%). Нити толщиной до 2.5 мкм встречаются в меньшем количестве (17 единиц, 34%). Нити толщиной до 10 мкм обнаружены в 3 случаях (6%). Диаметр сфер составляет около 10 мкм. Наибольшее количество МФ было обнаружено в высохшем мате (Рис.16). В более глубоких слоях травертина количество МФ уменьшается. Так, в образце сухого мата обнаружено 28 нитей и 67 сфер. В поверхностном слое травертина 19 нитей и 4 сферы. На глубине 5-18 см - 2 нити, на глубине 28-36 см - 5 нитей, на глубине 41-55 см - 1 нить, на глубине 83 см - МФ не обнаружены.

4. Исследование чистых культур, выделенных из микробных сообществ щелочных гидротерм

.1 Термофильная аноксигенная фототрофная бактерия Chloroflexus aurantiacus

При исследовании микробных сообществ нами было установлено широкое распространение в них бактерий Chloroflexus aurantiacus, достигающих значительной численности и даже входящих в число содоминант на некоторых станциях. Всего было исследовано 10 штаммов этих микроорганизмов: BG-28, Garga-2, Га9-8 (Гаргинский источник), ВG-39 (Уринский источник), BR(L) (Большереченский источник), ВG-6, A19-1 (Аллинский источник). Также культуры Chloroflexus aurantiacus были выделены из проб мата источника Змеиный (47°С), расположенного на территории Забайкальского национального парка (Z-1) и из источника Термофильный кальдеры Узон, Камчатка (UZ-2 и Green).

.1.1 Морфология и ультраструктура

Все культуры имели нитчатое строение (рис. 17) и были способны к скользящему движению. Нити неопределенной длины состояли из плотно соприкасающихся клеток цилиндрической формы. Длина клеток колеблется от 0.4 до 3 мкм, толщина клеток 0.40.7 мкм. Наиболее короткие клетки имел штамм BR(L), нити которых иногда состояли из почти квадратных клеток. Клетки размножались бинарным делением. Кроме того, была отмечена фрагментация трихома на группы клеток и отделение их от материнской нити. На ультратонких срезах видны хлоросомы, характерные для представителей зеленых бактерий (Рис. 17), а также электронно-прозрачные включения, являющиеся, очевидно, гранулами полибетаоксимасляной кислоты.

4.1.2 Пигменты

Цвет клеточной суспензии в анаэробных условиях варьировал от оливково-зеленого до зеленого, в аэробных условиях оранжевый или оранжево-зеленый. Все культуры имели идентичные спектры поглощения в анаэробных условиях. На спектрах in vivo (рис. 18) пики 460-461 и 739-741 нм указывают на присутствие в клетках бактериохлорофилла с. Пики 797-798 и 866 нм указывают на присутствие бактериохлорофилла а, а плечо 497-505 нм на наличие каротиноидных пигментов.

Ацетон-метанольные спектры (рис. 18) подтверждают преобладание бактериохлорофилла с и наличие бактериохлорофилла а у всех культур. Бактериохлорофилл с имел в коротковолновой части спектра максимум 436-437 нм и в длинноволновой - 666-670 нм. Бактериохлорофилл а определялся по поглощению при 769-771 нм.

.1.3 Физиология

Все культуры являются умеренными термофилами с диапазоном развития 35-60°С и оптимумом развития при 40-55°С (Рис. 19). Несмотря на наличие общих черт, температурные характеристики выделенных культур имеют ряд отличий. Культура Garga-2 и BG-28 имеют оптимум роста 55°С, BR(L) и BG-6 имеют оптимум роста при 50°С, BG-39 и Z-1 при 45°С, Green при 40°С. Наиболее активный рост был отмечен при рН 8.0-8.5. Наилучший рост штаммов Garga-2, BR(L), Green, BG-6, BG-28, Z-1 и UZ-2 наблюдался в пробирках в микроаэробной зоне (1 см от поверхности плотной среды с 1% агар-агаром), в отличие от них штамм BG-39 на всем протяжении времени культивирования сохранил анаэробный характер роста (3-4 см от поверхности плотной среды).

Микроорганизмы могли развиваться фотогетеротрофно анаэробно на свету и гетеротрофно аэробно в темноте. Также были способны медленно расти на минеральной среде с комплексом витаминов и 1.5 мМ сульфида. При росте в фотоавтотрофных условиях наблюдалось выпадение элементной серы вне клеток. Добавление сульфида в концентрации 0.5 мМ всегда стимулировало рост в анаэробных условиях. Сульфит не использовался в процессе фотосинтеза, но мог служить акцептором электронов для термофильных сульфидогенов, входящих в состав микробных сообществ исследованных источников. Толерантность штаммов Chloroflexus aurantiacus к сульфиду и сульфиту определялась при росте бактерий на средах с органическим веществом на свету. Штаммы BR(L), Green и Garga-2 наиболее активно росли при концентрации сульфида 2-3 мМ, сульфита - 4 мМ.

Рост Chloroflexus aurantiacus в присутствии закисного железа (0.56 г/л) исследовался на примере известного штамма OK-70f1 и штамма A19-1, выделенного нами из Аллинского источника.

При культивировании штаммов на минеральной среде с комплексом витаминов анаэробно на свету и в темноте рост отсутствовал, образования заметных чехлов на нитях не происходило, соотношение восстановленного и окисного железа в опыте и контроле не изменялось. При пересеве на среду, содержащую дополнительно 100 мг/л дрожжевого экстракта, рост обнаруживался. И в опыте и в химическом контроле медленно образовывался осадок темного цвета, вероятно магнетит, т.к. взвесь притягивалась магнитом.

При культивировании на среде содержащей 100 мг/л дрожжевого экстракта и закисное железо (0.56 г/л) аэробно в темноте было обнаружено образование чехлов окисного железа сходных с чехлами железобактерий Leptothrix (Дубинина, личное сообщение) (рис. 17). Толщина чехлов Chloroflexus aurantiacus была в 2-3 раза больше чем в отсутствие солей железа. После окраски желтой кровяной солью была обнаружена специфическая реакция на окисное железо - синее окрашивание. Все железо в среде находилось в окисном виде. В контроле с убитыми формалином клетками чехлы не образовывались, при этом окисное железо было распределено аморфно по дну флакона. Таким образом, исследованные штаммы Chloroflexus aurantiacus наиболее активно функционируют в ходе фотогетеротрофного роста. Также они способны использовать сульфид в качестве донора электронов в ходе фотоавтотрофного роста, в отличие от восстановленного железа, которое не может служить донором электронов при аноксигенном фотосинтезе. Это косвенно подтверждается незначительным стимулированием in situ фиксации 14С-бикарбоната пробами микробного мата содержащего Chloroflexus aurantiacus в присутствии диурона (неопубликованные данные). Образование чехлов окисного железа при аэробном гетеротрофном росте, видимо, происходит при реакции солей железа с перекисью водорода, как это было установлено для некоторых железобактерий. Таким образом можно ожидать, что при определенных экологических условиях Chloroflexus aurantiacus может участвовать в процессах осаждения окислов железа.

.1.4 Генотипические свойства и филогенетическое положение

По культуральным признакам, морфофизиологическим свойствам, пигментому составу и тонкому строению (присутствию хлоросом) все исследованные культуры были близки к известному виду термофильных нитчатых зеленых бактерий Chloroflexus aurantiacus. Была проведена ДНК-ДНК гибридизация выделенных штаммов с известным штаммом C.aurantiacus OK-70fl (Pierson, Castenholz, 1974). В результате было установлено, что штаммы BR(L), Garga-2, BG-39, BG-28, Z-1 и UZ-2 имеют от 87% до 96% гомологии с реперным штаммом OK-70fl. Более низкую степень гомологии имеют штаммы BG-6 (67%) и Green (56%), но эти величины сходства недостаточны для создания нового вида. По содержанию ГЦ пар выделенные штаммы (ГЦ от 53.7 до 55.5%) близки с реперным штаммом (54.9-55.6%). Таким образом, выделенные нами штаммы Chloroflexus aurantiacus как щелочных, так и нейтральных истосников могут быть отнесены к известному виду Chloroflexus aurantiacus (табл. 18).

4.2 Органотрофная аэробная термофильная бактерия

Из зоны I Аллинского источника с температурой 50-65°С, а также из Столбовского нейтрального сульфидного источника (о-в Кунашир, 55°С) были выделены два штамма (BG-7 и G-6) аэробной тиосульфат окисляющей гетеротрофной бактерии. Клетки представляют собой палочки диаметром 0.5 мкм, длиной 5-7 мкм, образуют неподвижные нити разной длины (рис. 20). Рост на поверхности твердой среды в чашке Петри происходил в виде ярко-красных, круглых, блестящих, компактных колоний. Рост жидкой культуры в виде слабой мути у поверхности. В метанольном экстракте обнаруживается три максимума поглощения при 443, 478 и 500 нм. Температурный диапазон роста 35-70°С с оптимумом роста 60°С. Для идентификации культуры было определено содержание ГЦ пар и проведена ДНК-ДНК гибрилизация с реперным типовым штаммом Meiothermus ruber штамм 21 (табл. 18). Сходство состава ГЦ и высокая степень ДНК-ДНК гибридизации между штаммом BG-7 и типовым штаммом "Логинова 21" (88%) показывают, что выделенная культура является Meiothermus ruber.

Таблица 19. Содержание ГЦ пар и уровень ДНК-ДНК гибридизации с типовым штаммом выделенной культуры Meiothermus ruber

У трех штаммов Meiothermus ruber (BG-7; G-6 из Столбовского нейтрального сульфидного источника (о-в Кунашир); Логинова 21, типовой) была исследована способность окислять тиосульфат. Установлено, что все три штамма окисляют тиосульфат после достижения лагфазы с образованием единственного продукта -сульфата (Рис. 21). Прибавка биомассы на среде с тиосульфатом не превышала 10%. Аналогичные данные были получены ранее Chung et al (1997). Таким образом, установлено вероятное участие Meiothermus ruber в окислительной фазе цикла серы в микробных матах термальных источников в широком диапозоне рН от 9.5 до 7.0 и температуре от 60 до 45°С.

.3 Термофильные сульфатредуцирующие бактерии

Из микробных матов источников Алла и Гарга были получены 4 накопительные культуры микроорганизмов, способных восстанавливать сульфат до сероводорода. Были очищены и более подробно изучены две культуры - Garga и Al-4. Garga был изолирован из зоны I Гаргинского источника с температурой 57°С. Al-4 был выделен из зоны I Аллинского источника с температурой 60°С. Микроорганизмы имели сходную морфологию и представляли собой вибрионы и слабоизвитые спириллы с полярным жгутиком (Рис. 22). Размер клеток 0.7*1-1.5 мкм. Клетки размножаются бинарным делением. Бактерии являются строгими анаэробами. Наиболее благоприятным источником углерода для них является лактат-Na, рост на ацетате у них отсутствовал. В качестве акцептора электронов могли служить сульфат и сульфит, но не тиосульфат, элементная сера и полисульфид. Температурный диапазон развития 40-70°С, оптимум 60°С. Диапазон рН штамма Garga от 6 до 8.5, оптимум 7.2. Диапазон рН штамма Al-4 от 6 до 9.5, оптимум 8 (Рис. 23). По морфофизиологическим свойствам и способности к термофилии выделенные бактерии сходны с представителями рода Thermodesulfovibrio. Таким образом, сульфатредуцирующие бактерии могут участвовать в восстановительной фазе цикла серы в микробных матах термальных источников в диапазоне рН от 8.4 до 9.0-9.9 и температуре от 40 до 70°С. Как было отмечено нами ранее, сульфатредукторы являются основными терминальными деструкторами во всех исследованных матах, в том числе и в бессульфидных гидротермах.

4.4 Алкалотермофильная органотрофная бактерия "Anaerobranca californiensis"

При посеве проб грунта из зоны с температурой 45-94°С источника на острове Паоха была выделена чистая культура сероредуцирующей бактерии, штамм Paoha-1.

.4.1 Морфология и ультраструктура

Клетки штамма Paoha-1 представляют собой прямые палочки, иногда ветвящиеся, 0.26-0.31 мкм в диаметре и 2.4-5.0 мкм длиной (Рис. 24). Иногда клетки образовывали ответвления (бранки). Жгутики расположены перитрихально. На ранней экспоненциальной стадии роста клетки подвижные, на стационарной стадии роста подвижность теряется. Споры не обнаружены.

Исследование ультраструктуры клеток штамма Paoha-1 выявило строение, характерное для грамположительных бактерий: отсутствие наружной мембраны, тонкая клеточная стенка, хотя клетки окрашиваются как Грам-отрицательные. Бинарное деление клеток осуществляется путем врастания клеточной перегородки. Наружный слой клеточной стенки имеет нерегулярное строение и высокую электронную плотность. Цитоплазма гранулярная и имеет включения с низкой электронной плотностью. Строение клеточной стенки и размер клеток Anaerobranca californiensis схожи с A. horikoshii (Engle et al., 1995), но отличаются от A. gottshalkii, клетки которой имеют большие размеры и толстую клеточную стенку (Prowe, Antranikian, 2001)

.4.2 Физиологические характеристики

Paoha-1 является облигатным анаэробом, способна существовать без добавления редуктантов. Культура нечувствительна к кислороду и может храниться в аэробных условиях при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Температурный диапазон роста и продукции сульфида из тиосульфата штамма Paoha-1 45-70°С, оптимум при 58^oC. Диапазон рН 8.6-10.4, оптимум pH 9.0 - 9.5 (измерение проводилось при 25^oC).

При температурах от 47°C до 58°C и рН 9.5 продукция сульфида в зависимости от концентрации NaCl имела широкий оптимум от 5 г/л (85 мМ) до 60 г/л (1М), тогда как при 70°C оптимум наблюдался при 25 г/л (430 мМ) NaCl. Оптимум концентрации не проводилось Na+ (NaCl + карбонаты) находился от 310 до 775 мМ в зависимости от температуры. Для сравнения, оптимум роста A. horikoshii и A. gotschalki наблюдался при 8.5 мМ Na+ и 230 мМ соответственно (Engle et al., 1995; Prowe, Antranikian, 2001).

Штамм Paoha-1 способен расти гетеротрофно на различных субстратах, наилучший рост наблюдается на пептоне, триптоне, соетоне, гидролизате казеина, дрожжевом экстракте. Способен к медленному росту на фруктозе, сахарозе, мальтозе, крахмале, гликогене, декстрозе, целлобиозе и глицерине в присутствии дрожжевого экстракта (0.01%) как фактора роста. Гликоген, глюкозу и целлюлозу не использует. Пируват используется, но ацетат и лактат не поддерживают рост. Таким образом, метаболизм Anaerobranca californiensis сходен с A. horikoshii (Engle et al., 1995). Как и другие ранее описаные анаэробные алкалотермофилы Paoha-1 нуждается в добавлении дрожжевого экстракта, который не может быть заменен витаминами (Wiegel, 1998). Рост без добавления тиосульфата или других неорганических соединений был слабым, возможно из-за ингибирования восстановленными продуктами брожения.

Диссимиляторная редукция фумарата, сульфата, сульфита и нитрата не обнаружена. Способен восстанавливать тиосульфат, полисульфид и элементную серу до сульфида. Обладает высокой толерантностью к сульфиду (до 40 мМ). Способен восстанавливать тиосульфат с образованием сульфита и сульфида в соотношении 1:1. Таким образом, при восстановлении тиосульфата штаммом Paoha-1 происходит восстановление только сульфанового атома серы, как было показано ранее для мезофильного бродильщика Proteus vulgaris (Barret, Clark, 1987). Нами было также показано, что типовые виды двух других известных видов A. horikoshii и A. gotschalkii способны восстанавливать тиосульфат с образованием сероводорода на среде с пептоном (для A. horikoshii) или глюкозой (для A. gotschalkii) как источниками углерода.

Таблица 19. Образование сульфида из различных серных соединений и восстановление цитрата железа тремя известными видами рода Anaerobranca

В дальнейших экспериментах было установлено, что штамм Paoha-1 на среде с пептоном и дрожжевым экстрактом также способен восстанавливать цитрат железа (III), гидроокись железа (III), селенат натрия (Se(VI)). Восстановление селенита (Na₂SeO₃) приводило к образованию промежуточного продукта - элементного селена Se° или полиселенита (красный аморфный осадок) и далее к образованию конечного продукта Se(II) в виде бесцветного селенида натрия (Na2Se). Штамм Paoha-1 восстанавливал Fe(III)-цитрат с большей скоростью чем элементную серу или тиосульфат. В эксперименте происходило внеклеточное образование минерала темного цвета, притягивающегося магнитом (вероятно магнетита). В химическом контроле был обнаружено незначительное содержание восстановленного железа, что подтверждает gottschalkii способны восстанавливать цитрат железа, селенит и элементную серу (Таб. 21). Можно сделать вывод, что способность к восстановлению этих неорганических соединений общее свойство всех известных представителей Anaerobranca. Штамм Paoha-1 также восстанавливал гидроокись железа на среде содержащей триптон (2 г/л) и дрожжевой экстракт (1 г/л).