Магистерская работа: Сравнительное исследование микробных сообществ щелочных слабоминерализованных гидротерм Байкальской рифтовой зоны и щелочных минерализованных гидротерм озера Моно-Лейк на острове Паоха

Хемотрофные микробные сообщества нейтральных гидротерм. Максимальные значения продуктивности хемотрофных термофильных сообществ значительно уступают продуктивности фототрофных термофильных сообществ и продуктивности хемотрофных мезофильных сообществ. Скорость темновой фиксации углекислоты в "белом" мате с доминированием Thermothrix thiopara источника Термофильный составляет 0.017 гС/м² сут (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989). В источнике Пульсирующий (Камчатка) максимальная темновая фиксация углекислоты составляет 212 мкгС/л сут (Бонч-Осмоловская и др., 1999).

Несмотря на ключевую роль хемосинтетической продукции в функционировании глубоководных гидротермальных сообществ, количественная сторона этой "роли" остается слабо изученной (Гебрук, Галкин, 2002). Бактериальная продукция в бактериальных обрастаниях на отложениях дна в пределах активных полей в среднем составляет около 11 мг С/м² сут. Суммарная бактериальная продукция с учетом всех зон на одном поле составляет в среднем 275 мг С/м² сут (Леин, Пименов, 2002).

В источнике Термофильный скорость сульфатредукции в "белом" мате составляет 0.038 tS/м² сут, скорость метаногенеза 0.0129 мгС/м² сут. Интересно, что скорость сероредукции составляет 0.096 tS/м² сут, эта величина превышает сульфатредукцию в той же зоне в 2.3 раза. Таким образом, в присутствии элементной серы сероредукция успешно конкурирует с другими процессами. Обращает на себя внимание несбалансированность продукционных и деструкционных процессов в "белом" мате. В отличие от "зеленого" мата с доминированием цианобактерий, где продукция органического вещества значительно превышает деструкцию, в "белом" мате деструкция превышает продукцию в 5 раз (Горленко, Бонч-Осмоловская, 1989).

В источнике Пульсирующий скорость автотрофного метаногенеза достигает 0.26 мкгС/л сут и скорость ацетогенеза 9.58 мкгС/л сут. Также была отмечена высокая потенциальная способность к литотрофному восстановлению сульфатов и серы, железа, образованию метана, анаэробному окислению СО, сопряженному с образованием водорода. Литотрофный ацетогенез был незначителен (Бонч-Осмоловская и др., 1999).

Высокая активность терминальных деструкционных процессов была обнаружена в подводных гидротермах. Скорость сероредукции в грунте бухты Матупи (Новая Гвинея) достигает 57 tS/л сут (Бонч-Осмоловская и др., 1993). В илу вулканической воронки с глубины 40 м залива Пленти (Новая Зеландия) с температурой 85°С скорость сульфатредукции достигает 1655.2 мк^/л сут, метаногенеза из СО₂ достигает 5.84 мкгС/л сут, из ацетата - 16.3 мкгС/л сут (Намсараев и др., 1994). В глубоководных гидротермах Гуаймас Калифорнийского залива с глубины 2010 м (50-70еС) скорость сульфатредукции достигает 1024 мкгё/л сут (Jorgensen et al., 1990).

.4 Экофизиология термофильных микроорганизмов щелочных гидротерм

.4.1 Температурные и рН границы развития микроорганизмов

Существуют различные классификации микроорганизмов по отношению к температуре (Заварзин, Колотилова, 2001; Castenholz, Pierson, 1995; Wiegel, 1998). Как правило, к термофилам относят микроорганизмы с оптимумом развития при температурах свыше 50°С. Среди них выделяют еще несколько групп. Собственно термофилы с оптимумом при 50°С и максимальной температурой роста выше 60°С. К экстремальным термофилам относятся микроорганизмы с минимальной температурой роста обычно свыше 35°С, оптимумом развития выше 65°С и максимальной температурой роста выше 70°С. К гипертермофилам относятся микроорганизмы с минимальной температурой роста обычно свыше 60°С, оптимумом развития выше 80°С и максимальной температурой роста при температурах выше 85°С (Wiegel, 1998). По данным Штеттера и соавторов (Bluhl et al., 1997) верхний температурный предел развития гипертермофильных микроорганизмов составляет 113°С.

Существуют различные классификации микроорганизмов по отношению к рН (Заварзин, Колотилова, 2001; Krulwich, Guffanti, 1989; Wiegel, 1998). По Вигелю, к алкалофилам относят микроорганизмы с оптимумом рН выше 8.5 и максимальным рН развития выше 10. Выделяют также группы факультативных алкалофилов с минимальным рН развития менее 8 и облигатных алкалофилов с минимальным рН выше 8. К алкалотолерантам относятся организмы с оптимумом рН менее 8.5 и максимальным рН развития выше 9 (Wiegel, 1998). Необходимо учитывать, что при измерении рН в щелочной области при высоких температурах необходимо вносить поправки, либо калибровать электрод при температуре измерения. Ошибка измерения может достигать одной единицы рН (Wiegel, 1998).

.4.2 Микроорганизмы - первичные продуценты

Цианобактерии. Большинство термофильных (и мезофильных) цианобактерий более активно развивается в щелочных условиях. При культивировании на слабо забуференных средах происходит подщелачивание среды в ходе оксигенного фотосинтеза (Holm-Hansen, 1968; Castenholz, 1969). Так, скорость фотосинтеза нитчатой цианобактерии Phormidium molle не меняется при изменении рН от 7.3 до 9.6 и падает при рН 10.4 (Герасименко, 2002).

Максимальная постоянная температура, при которой могут существовать цианобактерии - 74°С, верхний температурный предел развития Synechococcus lividus (Castenholz, 1969, 1984). Броком было показано, что фиксация 14С-бикарбоната в процессе фотосинтеза популяцией Synechococcus sp. может происходить при температуре 73°С (Brock, 1967). Другие виды цианобактерий могут существовать в культуре при температурах: Synechococcus elongatus до 70°С, Mastigocladus laminosus до 64°С, Phormidium laminosum, P. tenue, P. valderiae до 57°С, Oscillatoria terebriformis до 53°С, Oscillatoria tenue до 47°С. Отмечено развитие в природе следующих видов цианобактерий: Synechococcus minervae до 60°С, Oscillatoria okenii до 60°С, Oscillatoria amphibia до 57°С, Oscillatoria animalis до 55°С, Pleurocapsa minor до 54°С, Calothrix sp. до 54°С, Synechococcus aquaticus до 50°С. Нижний температурный предел развития большинства термофильных цианобактерий составляет 30-35°С (Castenholz, 1969).

Микроаэрофильные условия и присутствие восстановителей в небольших количествах оказывают стимулирующее воздействие на рост цианобактерий (Герасименко, Заварзин, 1982; Герасименко и др., 1987; Герасименко, 2002). Но высокое содержание сульфида подавляет оксигенный фотосинтез цианобактерий (Пиневич, Аверина, 2000). Наиболее токсичен сульфид при низких значениях рН из-за более высокой способности недиссоциированного сероводорода к проникновению через клеточные мембраны (Howsley, Pearson, 1979). В этих условиях цианобактерии переключаются с оксигенного на аноксигенный фотосинтез, используя сульфид в качестве донора электронов для фотосистемы I, либо защищают фотосистему II от ингибирования сульфидом (Венецкая и др. 1987; Castenholz, Utkilen, 1984; Cohen, 1984; Cohen et al. 1975; Cohen et al., 1986). Тиосульфат и элементная сера не могут служить донорами электронов для аноксигенного фотосинтеза у цианобактерий (Castenholz, 1976). Вероятно, древние цианобактерии существовали в сульфидсодержащих условиях. При этом использование воды, как донора электронов, первоначально могло быть способностью позволяющей переносить временное отсутствие сульфида (Cohen, 1984).

Железо может служить донором электронов для мембран связаных комплексов фотосистемы II (Dismukes et al., 2001). Коэном было показано, что цианобактерии Oscillatoria sp. и Microcoleus chtonoplastes осуществляют Fe(II)-зависимую фотоассимиляцию СО2. Процесс ингибируется диуроном, что свидетельствует о том, что железо донирует вторую фотосистему. Конечный продукт, оксид железа, выделяется в среду подобно выделению элементной серы в сульфидзависимом аноксигенном фотосинтезе (Cohen et al., 1986). Пирсон было показано, что в железистом нейтральном источнике Чоколейт пот (Йеллоустон) происходит образование чехлов окисного железа вокруг нитей цианобактерий (Pierson et al., 2000). Эксперименты со стимулированием закисным железом фиксации 14С-бикарбоната показали, что наибольшее стимулирование (до 500% фотоассимиляции, до 175% темновой фиксации) происходит при добавлении 1 мМ закисного железа (56 мг/л). Стимулирование фиксации железом выше в пробах мата из более высокотемпературных зон с доминированием Synechococcus sp., чем в зонах с умеренной температурой и доминированием Oscillatoria sp. (Pierson et al., 1999).

Большинство цианобактерий является облигатными фотоавтотрофами. Относительно небольшое количество цианобактерий способно существовать как аэробные гетеротрофы в темноте, но скорость роста при этом значительно уступает росту в фотоавтотрофных условиях. Анаэробный метаболизм в темноте ограничен брожением и используется для поддержания существования в неблагоприятных условиях (Stal, 1995). Способность к восстановлению серных соединений при брожении была показана у мезофильных цианобактерий, но у термофильных цианобактерий не известна (Oren, Shilo, 1979; Moezelaar et al., 1996).

Аноксигенные фототрофные бактерии (АФБ). Известно всего девять видов термофильных АФБ (Castenholz, Pierson, 1995; Hanada et al., 1995a, b; Hanada et al., 2002). Из них способны существовать в культуре, или показано существование в природе, при рН выше 8.5 только термофильные нитчатые зеленые бактерии. Также для несерных пурпурных бактерий Rhodopseudomonas palustris и Rh. gelatinosus было показано существование в природе при рН 9.2-9.8 и температуре выше 50°С, но они не были способны к росту при высоких температурах в лабораторных условиях. Высказано предположение, что бактерии либо переживают неблагоприятные условия, периодически активируясь при снижении температуры, либо в мате существуют условия, при которых возрастает верхний предел их толерантности к температуре. Оба организма имели оптимум рН около 7 и не проявляли тенденции к алкалофилии (Горленко и др., 1985; Компанцева, Горленко, 1988). Аналогичное явление было обнаружено для культур несерных пурпурных бактерий родов Blastohloris, Phaeospirillum, Rhodoplanes, Rhodopseudomonas, Rubrivivax выделенных из матов развивающихся при 55-65еС (источник Накабуса, Япония), но растущих в лабораторных условиях при температурах не выше 43-48еС (Okamura et al., 2003).

Термофильные нитчатые АФБ широко распространены в гидротермах с температурой до 72°С и рН от 6.2 до 10.4. В настоящее время известно четыре вида: Chloroflexus aurantiacus, Chloroflexus aggregans, Roseiflexus castenholzii, Heliothrix oregonensis. Культивируемые организмы обладают оптимумом рН 7-8, Chloroflexus aggregans и Roseiflexus castenholzii были обнаружены только в источниках с рН не выше 8, но Chloroflexus aurantiacus и Heliothrix oregonensis были обнаружены в источниках с рН до 10.4 (H. oregonensis с pH 8.5) (Юрков и др., 1991; Pierson, Castenholz, 1974; Castenholz, Pierson, 1995; Hanada et al., 1995a, b; Hanada et al., 2002; Blanck et al., 2002; №>bel et al., 2002).

Наиболее изученным представителем этой группы является Chloroflexus aurantiacus. Его оптимум роста 52-60°N, максимальная температура роста ~70°С (Pierson, Castenholz, 1974). Chloroflexus aurantiacus не способен к фиксации молекулярного азота (Heda, Madigan, 1986). Наиболее быстро рост всех выделенных штаммов происходит фотогетеротрофно (Castenholz, Pierson, 1995). Ряд штаммов способны к медленной сульфидзависимой фотоавтотрофии с образованием молекулярной серы (Кеппен, Красильникова, 1986; Madigan, Brock, 1975; Giovannoni et al., 1987). Тиосульфат, сульфит, молекулярная сера не могут использоваться в качестве доноров электронов, но могут использоваться в качестве акцепторов электронов восстанавливаясь до сероводорода на среде с органическими соединениями в темноте (Кондратьева, Красильникова, 1988). Также в темноте организм способен расти в аэробных условиях за счет дыхания и в анаэробных условиях за счет сбраживания углеводов или пирувата (Красильникова и др., 1986; Красильникова, Кондратьева, 1987). Красильникова и Кондратьева (1987) сообщают, что Chloroflexus aurantiacus в темноте в анаэробных условиях в присутствии глюкозы восстанавливает окисное железо. Ранее активность железоредуктазы и редукция железа мембранными фракциями была показана у мезофильных АФБ (Moody et al., 1985; Dobbin et al., 1996). Образование чехлов окисного железа наблюдалось у мезофильного штамма Chloroflexus aurantiacus в микроаэрофильных условиях при развитии на среде с 0.01% триптона и порошком металлического железа (Горленко, 1981). При этом бактериальные нити выползали из чехлов, что приводило к накоплению большого количества чехлов, неотличимых от чехлов Leptothrix. Окисление железа, скорее всего, не является источником энергии для фиксации СО2, а связано с действием перекиси водорода, образующейся в процессе окисления органического субстрата (Дубинина, 1977). Это может являться одним из механизмов участия бактерий в генезисе железистых минералов древних осадочных месторождений ганфлинтского типа. Способность Chloroflexus aurantiacus к использованию восстановленного железа как донора электронов для фотосистемы I не была исследована. Ранее было показано, что мезофильные АФБ способны использовать закисное железо как донор электронов (Widdel et al., 1993; Ehrenreich et al., 1994).

Heliothrix oregonensis не был выделен в чистую культуру. Клетки более толстые, чем у Chloroflexus aurantiacus (1.5 мкм и 0.5-1.0 мкм соответственно), хлоросомы отсутствуют. Бактериохлорофилл а - единственный пигмент. Проявляет себя как фотогетеротроф толерантный к кислороду или даже нуждающийся в кислороде. Растет в диапазоне температур от 35 до 56-60°С с оптимумом в пределах 40-55°С. Устойчив к высоким интенсивностям света до 32 клюкс. Heliothrix oregonensis найден преимущественно в микробных матах щелочных источников с рН около 8.5, в которых он образует верхний слой оранжевого цвета (Pierson et al., 1984, 1985).

Chloroflexus aggregans и Roseiflexus castenholzii гораздо менее изучены чем Chloroflexus aurantiacus. Основные характеристики этих организмов очень похожи. Эти бактерии способны к фототрофному росту на органических субстратах, а также к гетеротрофному аэробному росту в темноте. Отличия заключаются в следующем: клетки Chloroflexus aggregans более толстые (до 1.5 мкм), скорость скольжения нитей по поверхности примерно в 100 раз выше, есть способность к быстрому образованию аггрегатов в жидкой среде (за 20-30 минут), не способен к использованию ацетата, цитрата, этанола и глицил-глицина (Hanada et al., 1995b). Roseiflexus castenholzii не обладает хлоросомами и бактериохлорофиллом с и содержит только бактериохлорофилл а (Hanada et al., 2002).

Хемолитоавтотрофные алкалотермофильные микроорганизмы в настоящее время не известны (Кевбрин, личное сообщение; Wiegel, 1998). Единственным известным хемолитоавтотрофным термофильным алкалотолерантным организмом является метаногенная археобактерия Methanothermobacter thermoautotrophicum (ранее Methanobacterium thermoautotrophicum, синоним M. thermoalcaliphilum) способная существовать при рН 9 и обладающая оптимумом рН 7.7.7.8 (Zeikus, Wolfe, 1980; Blotevogel et al., 1986).

.4.3 Микроорганизмы - деструкторы

Аэробные и факультативно аэробные органотрофные микроорганизмы. Валидно опубликованные алкалофильные термофильные аэробные микроорганизмы в настоящее время не известны. Недавно Мартинссон с соавторами обнаружили в щелочных субаквальных гидротермах Эйджафьордур аэробные органторофные микроорганизмы способные существовать в лабораторных условиях при рН 10 и температуре 60-72°С. По результатам анализа 16S-рРНК (на основании анализа 400-500 пар нуклеотидов, сходство 95-99%) изоляты были отнесены к видам Geobacillus thermoleovorans, "G. caldotenax", G. flavothermus, G. caldovelox (Marteinsson et al., 2001). Тем не менее, типовые штаммы данных организмов не способны расти при рН выше 8 (Назина, Григорьян - личное сообщение).

Известные микроорганизмы являются либо "самыми "алкалофильными" среди термофилов, либо самыми "термофильными" среди алкалофилов" (Wiegel, 1998). Оптимумом рН выше 8.5 обладает Bacillus sp. штамм 221, способный расти до рН 10 и максимальной температурой роста 57°С, являющийся алкалофилом, но не термофилом (Horikoshi, 1990, Wiegel, 1998). Среди термофильных микроорганизмов известен ряд аэробных алкалотолерантных бактерий (археобактерии неизвестны). Это представители рода Bacillus (B. pallidus, B. thermocloaceae, B. thermoaerophilus), рода Meiothermus (M. chliarophilus, M. ruber, M.silvanus), "Geobacillus caldotenax", Thermus oshimae, Sphaerobacter thermophilus, Thermomicrobium roseum, Isosphaera pallida, Rubrobacter xylanophilus (Wiegel, 1998). Храпцова и соавторы выделили из термальных источников Бурятии ряд алкалитолерантных термофильных аэробных микроорганизмов с оптимумом роста при 50°С и рН 8.0 (Храпцова и др., 1984).

О способности к использованию неорганических соединений термофильными аэробными органотрофными микроорганизмами известно мало. Meiothermus ruber способен к окислению тиосульфата с образованием сульфата, причем добавление тиосульфата не стимулировало рост (Chung et al., 1997). Способность к окислению тиосульфата, а также восстановлению элементной серы и ряда металлов была обнаружена у представителей рода Thermus, кроме Thermus oshimae (Kieft et al, 1999; Skirnisdottir et al., 2001).

Анаэробные органотрофные микроорганизмы. В настоящее время в этой группе известно семь видов анаэробных алкалотермофильных микроорганизмов. К ним относятся археи Methanohalophilus zhilinae, Thermococcus alcaliphilus, бактерии рода Clostridium (C. paradoxum, C. thermoalcaliphilum), Anaerobranca gottschalkii, Thermosyntropha lipolytica, Desulfotomaculum alkaliphilum (Mathrani et al., 1988; Li et al., 1993, 1994; Keller et al., 1995; Svetlitshnyi et al., 1996; Wiegel, 1998; Pikuta et al., 2000). К анаэробным термофильным алкалотолерантным микроорганизмам относятся археи Methanobacterium thermoflexum, Thermococcus fumicolans, бактерии Anaerobranca horikoshii, Thermobrachium celere, Caloramator indicus, Thermoanaerobacter ethanolicus (Wiegel, Ljundgahl, 1982; Kotelnikova et al., 1993; Engle et al., 1995; Chrisostomos et al., 1996; Godfroy et al., 1996; Wiegel, 1998). Все организмы являются органогетеротрофами, о способности к использованию неорганических соединений известно немного. Desulfotomaculum alkaliphilum способен восстанавливать сульфат, сульфит, тиосульфат, но не элементную серу и нитрат (Pikuta et al., 2000). Thermococcus alcaliphilus способен восстанавливать полисульфид и элементную серу (Keller et al., 1995).