Магистерская работа: Сравнительное исследование микробных сообществ щелочных слабоминерализованных гидротерм Байкальской рифтовой зоны и щелочных минерализованных гидротерм озера Моно-Лейк на острове Паоха

Термальные воды источника Паоха обладают температурой 84-94°С, минерализацией 25 г/л, рН 9.7. Содержание сероводорода 55 мг/л. Воды хлоридного кальциевого-натриевого состава.

2.2 Методы полевых исследований

Пробы воды, почв для микробиологического анализа отбирали в стерильную посуду. Пробы мата для химических анализов и для радиоизотопных экспериментов отбирали пробочным сверлом площадью 1 см². Введение радиоизотопов и фиксацию проб для химических и микробиологических определений проводили сразу после отбора проб. До проведения анализов пробы хранили в темноте в холодильнике.

В местах отбора проб измеряли температуру, рН, окислительно-восстановительный потенциал (Eh), минерализацию. Температуру измеряли сенсорным электротермометром Prima (Португалия), рН определяли потенциометрически при помощи портативного рН-метра (рНер2, Португалия). Для определения окислительно-восстановительного потенциала использовали портативный измеритель redox-потенциала ORP (Португалия). Минерализацию воды определяли при помощи портативного тестер-кондуктометра TDS-4

Кислород в воде источника определяли методом Винклера (Резников и др., 1970). Концентрацию сульфида определяли колориметрически с парафенилендиамином на полевом спектрофотометре ПФЭК-П-2 (Tbper, Schlegel, 1964). Концентрации тиосульфата и сульфита определяли йодометрическим методом (Резников и др., 1970). Концентрацию сульфата определяли турбидиметрическим методом (Резников и др., 1970). Содержание железа определяли роданидным (Резников и др., 1970) и феррозиновым (Stookey, 1970) методами. Содержания карбонатов в полевых условиях определяли титрованием (Резников и др., 1970).

2.3 Методы лабораторных исследований

.3.1 Методы культивирования и изучения роста бактерий в зависимости от физико-химических факторов

Учет численности жизнеспособных клеток микроорганизмов проводили методом 10-ти кратных разведений на элективных средах. Выделение, учет численности и культивирование цианобактерий проводили на жидкой среде Кастенхольца (Castenholz, 1969). Выделение и учет численности аноксигенных фототрофных бактерии (АФБ) вели на агаризованной (0.2%) модифицированной среде Пфеннига (Pfennig, 1965), содержащей в литре дистиллированой воды: KH2PO4 - 0.5 г, NH4O - 0.5 г, MgSO4*7H2O - 0.5 г, KCl - 0.5 г, NaCl - 0.5 г, CaCl₂*2H₂O - 0.05 г/л, NaHCO₃ - 1.5 г/л, раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1мл (Pfennig, Lippert, 1966), витамин В₁₂ - 20 мкг, ацетат-Na - 1 г, дрожжевой экстракт -0.1 г, Na2S2Os*5H2O - 1 г, Na2S*9 Н2О - 0.3 г. рН среды доводили 0.1 М растворами HCl и NaOH до 8.0-8.5 при 25°С, температура инкубации 30 и 50°С.

Опыт по культивированию Chloroflexus aurantiacus в присутствии железа проводился на среде для АФБ со следующими изменениями: раствор фолиевой кислоты (0.02 г/л) и рибофлавина (0.05 г. л) - 1мл, раствор тиамина (0.05 г/л) и пантотеновой кислоты (0.05 г/л) - 1 мл, раствор никотиновой кислоты (0.05 г/л), биотина (0.02 г/л), ПАБК (0.05 г/л), пиридоксина (0.1 г/л) - 1мл, NaHCO₃ - 2 г/л, FeSO₄*7Н₂О - 2.8 г, из состава среды удалены Na₂S₂O₃*5H₂O, Na₂S*9 Н₂О, ацетат-Na и дрожжевой экстракт. рН устанавливался 7.2. Инокулят был подготовлен на среде с 100 мг/л дрожжевого экстракта. Эксперимент проводился в 3 повторностях. Среда по 30 мл анаэробно разливалась в пузырьки по 50 мл, продувалась азотом. Культивирование проводилось при 50°С. Анаэробный рост в темноте проверялся на среде аналогичного состава содержащей 100 мг/л дрожжевого состава в пузырьках на 50 мл заполненых наполовину, культивирование проводилось под ватными пробками при 50°С. рН устанавливали 7.5 при 25°С.

Выделение и культивирование штаммов Meiothermus ruber проводилось на среде для АФБ со следующими изменениями: NaHCO₃ - 0.5 г, дрожжевой экстракт - 0.5 г, из состава среды удалены ацетат-Na и Na₂S*9 Н₂О. рН устанавливали 7.5-8.5 при 25°С. Температура инкубации 50°С. Культивирование проводили в колбах заполненых средой наполовину, под ватными пробками, и на агаризованой (0.2%) среде того же состава.

Выделение и культивирование "Anaerobranca californiensis" проводилось на среде для АФБ со следующими изменениями: MgSO₄*7H₂O - 0.2 г, Na₂SO₄ - 0.5 г, NaCl - 25 г, NaHCO3 - 5 г, Na2CO3 - 5 г, дрожжевой экстракт - 2 г, цистеин - 0.25 г, пептон - 1 г, из состава среды удалены CaCl₂*2H₂O и ацетат-Na. рН устанавливали 9.3-9.7 при 25°С.

Температура инкубации 58°С. Культивирование проводили в полностью заполненных пузырьках, либо на чашках Петри с Gel-Gro^tm (1.2%) (ICN Biochemicals, Ohio, USA) со средой того же состава, в последнем случае культивирование проводилось в анаэростате в атмосфере азота.

Штаммы Anaerobranca horikoshii (DSM 9786) и A. gottschalkii (DSM 13577) культивировали на среде использовавшейся для культивирования "A. californiensis" со следующими изменениями. Для A.gottschalkii: глюкоза - 2 г, NaCl - 10 г, из состава среды уделен Na2S*9H2O. Для A. horikoshii: NaCl - 0.5 г, фумарат - 1.5 г, Ш2Ш3 - 1.8 г, NaHCO3 -1.8 г, Na₂S*9H₂O - 0.125г. рН в обоих случаях устанавливали 9.3-9.7 при 25°С. Температура инкубации 58°С.

Выделение и культивирование Ectothorhodospira shaposhnikovii проводилось на среде для АФБ со следующими изменениями: NaCl - 10 г, Na₂CO₃ - 5 г, NaHCO₃ - 5 г, дрожжевой экстракт - 1 г. рН устанавливали 9.3-9.7 при 25°С. Температура инкубации 25°С.

Выделение и культивирование штаммов термофильных сульфатредуцирующих бактерий проводили на модифицированной среде Постгейта (Кузнецов, Дубинина, 1989), содержащей в литре дистиллированой воды: KH₂PO4 - 0.5 г, NH₄Cl - 1 г, CaCl₂*2H₂O - 0.3 г, Na2SO3 - 0.7 г, MgCb *6H2O - 0.3 г, NaCl - 1 г, NaHCO3 - 0.5 г, Na2S*9H2O - 0.1 г, раствор микроэлементов по Пфеннигу - 1мл (Pfennig, Lippert, 1966), витамин В₁₂ - 20 мкг, дрожжевой экстракт - 0.5 г, лактат натрия - 3.5 г. рН среды доводили 0.1 М растворами HCl и NaOH до 8 при 25°С. Температура инкубации 58°С. Культивирование проводили в полностью заполненных пузырьках, либо на агаризованой (0.2%) среде того же состава.

Определение видовой принадлежности цианобактерий проводили на основании морфологических признаков по определителю Голлербах и др. (1953). Идентификацию аноксигенных фототрофных бактерий проводили по совокупности фенотипических признаков (морфологии клеток, содержанию хлорофилла и каротиноидов, способности к гетеротрофному и автотрофному росту на сульфиде, способности к росту аэробно в темноте, отношению к температуре и рН среды). Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате по описанной ранее методике (Юрков и др., 1991). Диапазон рН определялся с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия. Для ряда бактерий определение температурного оптимума и оптимума рН проводили в краткосрочных опытах с помощью 14 С-бикарбоната по описанной ранее методике (Горленко, Кикина, 1979). Диапазон развития при разной минерализации среды определялся с разными концентрациями хлорида натрия, бикарбоната и карбоната натрия. Способность к использованию различных источников углерода проверяли на средах содержащих 0.1 г/л дрожжевого экстракта, в которую вносили испытуемые источники углерода в концентрации 2 г/л. Способность к использованию неорганических соединений проверяли на средах, содержащих 0.1 г/л дрожжевого экстракта, в которые были внесены испытуемые соединения в конечной концентрации 0.5-10 мМ. Биомассу бактерий определяли по изменению оптической плотности культуры при длине волны 650 нм на фотометре КФК-3. Спектр поглощения клеток АФБ определяли в ацетон-метанольных экстрактах (7:2) и in vivo в 50% растворе глицерина. Клетки предварительно разрушали с помощью ультразвука. Биохимические свойства бактерий, удельную скорость роста, численность бактерий определяли общепринятыми методами (Герхардт, 1984).

.3.2 Методы электронной микроскопии

Для приготовления ультратонких срезов бактериальные клетки фиксировали по Ryter&Kellenberger (1958) и заключали в смесь эпоксидных смол (эпон). Срезы получали на ультратоме LKB "Ultrotome Nova" и помещали на медные сеточки покрытые коллодиевой пленкой и напыленные углеродом. Препараты окрашивали по Reynolds (1963). Тотальные препараты для электронной микроскопии получали обработкой клеток 1%-ной фосфовольфрамовой кислотой (ФВК), нейтрализованной щелочью до рН 7.

Анализ вертикальной структуры микробных сообществ с применением стекол обрастания и электронной сканирующей микроскопии проводился по описанной ранее методике (Юрков, Горленко, 1989). Сколы травертина просматривались под электронным сканирующим микроскопом, образцы прикреплялись к металлическому держателю с помошью углеродного клея. Исследуемая площадь на каждом образце составляла 0.05 мм².

Тотальные препараты, ультратонкие срезы, стекла обрастания и образцы травертина просматривали под электронным микроскопом JEM-100C или JEM-7 при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении от 8000 до 50000.

.3.3 Методы гено- и хемосистематики

Выделение и очистка ДНК проведены А.М. Лысенко по стандартным методам (Marmur, 1961). Содержание ГЦ в ДНК определяли по температуре плавления ДНК (T_m) и рассчитывали по формуле Оуэна (Owen et al., 1969), гомологию ДНК-ДНК изучали методом оптической реассоциации (De Ley, 1970) на приборе "Pye-Unicam SP 1800" (Англия). Амплификацию и секвенирование генов 16S рРНК выделенных чистых культур проводился компанией MWG Biotech (High Point, North Carolina) с использованием следующих праймеров 5' -GTTTGATCCTGGCTCAG-3', 5' -ACGGYTACCT-TGTTACGACTT-3' и использованием специального набора TA cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, California).

Анализ последовательностей генов 16S рРНК выделенных штаммов был выполнен Т.П. Туровой с использованием программного обеспечения Ribosomal Database Project. Укорененное филогенетическое дерево исследуемых бактерий было создано с помощью пакета программ TREECON (Van de Peer, De Wachter, 1994).

.3.4 Методы определения скорости микробных процессов

Пробы воды и почвы для радиоизотопных работ отбирали в стерильные флаконы, которые закрывали пробками и обжимали алюминиевыми крышками. Радиомеченные вещества вводили в пробу с помощью шприца. При этом лишний объем воды из флакона вытесняли через иголку. Инкубацию проводили на свету и в темноте, поместив в воду источника на месте отбора пробы на 6-24 ч. Радиоактивность меченных соединений определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rackbetta (Швеция).

Для определения световой и темновой продукции использовали NaH¹⁴СO₃ (Иванов, 1956; Кузнецов, Романенко, 1963). В пробы вносили радиометку с активностью 25 мкк. Пробы фиксировали 10 N NaOH. Диурон (3-(3,4-дихлорофенил)-1,1-диметилмочевина) в конечной концентрации 7 дМ применяли для ингибирования оксигенного фотосинтеза. В ряде экспериментов проводилось стимулирование продукционных процессов цитратом железа в конечной концентрации 0-5 г/л железа. Пробы обрабатывали на установке УЗДН-2 с частотой 22 МГц и мощностью 0,4 мА в течение 2 минут. Фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтры промывали тремя объемами воды с рН 2-3, высушивали и измеряли радиоактивность. При определении интенсивности сульфатредукции использовали метод Иванова (1956). Для этого в пробу вносили 0,1-0,2 мл Na₂³⁵SO₄ с активностью 0,1-1 мКюри и инкубировали в течение 0,4-2 суток. Фиксацию интенсивности сульфатредукции производили путем введения в пробу 10-25 % раствора ацетата Cd.

Интенсивность метаногенеза измеряли с помощью №¹⁴НСО₂ (Лауринавичус, Беляев, 1978). Пробы фиксировали 10 N NaOH. Образовавшийся меченный метан продували и сжигали до ¹⁴СО2 при температуре 700⁰С. Образовавшийся после сжигания ¹⁴СН4 ¹⁴СО2 улавливали сцинтилляционным раствором, одним из основных компонентов которого был Р-дифенилэтиламин.

Для расчета интенсивности микробных процессов применяли следующую формулу:

А = гЩ

    R-t

где А - интенсивность процесса, C - концентрация субстрата, r - радиоактивность продукта реакции, R - радиоактивность введенного в пробу меченного субстрата, t - время инкубации.

Результаты определения скоростей микробиологических процессов радиоизотопным методом и балансовые уравнения реакции позволяют рассчитать количество использованного бактериями органического углерода:

Сульфатредукция Коэффициент расчета расхода С

Сорг + SO4^2- - S^2- + CO2 24 г С32 г S0,75

Метаногенез

Н2 + 4CO2 - СН4 + Н2О + 3CO2

г С 12 г С4

2.3.5 Методы определения содержания пигментов в микробных матах

Определение содержания хлорофилла а в микробных матах гидротерм Б.р.з. проводилось спектрофотометрически в этанольных экстрактах. Для расчетов содержания хлорофилла а использовали формулу:

мг (хл a) = 11.9*OD₆₆₅*(v/l),

где OD₆₆₅ - оптическая плотность при длине волны 665 нм, v - объем экстракта в мл, l - длина кюветы (A manual..., 1969). Присутствие бактериохлорофилла с в образцах микробных матов определялось по наличию длинноволнового максимума на спектрах in vivo при 740 нм.

3. Исследование микробных сообществ щелочных гидротерм

В данном разделе рассматриваются микробные сообщества исследованных нами термальных источников Б.р.з. и минерализованного озера Моно Лейк в порядке повышения рН воды на изливе источников.

.1 Гаргинский источник

.1.1 Распространение и видовой состав микробных сообществ в связи с изменением физико-химических условий среды

Выход источника покрыт серым песком. Температура воды на выходе составляет 75°С, в воде источника присутствует менее 0.1 мг/л сульфида, рН воды на выходе 7.7.

Таблица 2. Физико-химические условия в биологических зонах Гаргинского источника

На расстоянии 3 метров от выхода (при температуре 74-70°С) дно русла покрыто черным осадком MnO. Микробные маты появляются на расстоянии 7-10 метров от выхода, при температуре 57°С (таб. 2, рис. 2а). По нашим наблюдениям расположение русла в этой области периодически изменяется. Вероятно, это связано с литификацией микробных матов, либо с хемогенным осаждением карбоната кальция. Далее по изливу источника рН воды повышается с 7.7 до 9.1 в результате дегазации СО2 и фотосинтетической активности микробных сообществ.

Во время наблюдений проведенных в 1997, 1999, 2000, 2001, 2002 годы расположение микробных матов было различным в связи с периодическими изменениям русла источника и литификацией микробного мата, тем не менее типы микробных сообществ в различных температурных зонах источника были неизменными. На выходе источника (Т 75°С) и в зоне выпадения черного осадка MnO видимых микробных обрастаний нет, что может быть объяснено высокой скоростью минералообразования в источнике (рис. 2б).

При температуре 57°С, рН 8.4 и при практическом отсутствии сульфида в воде по дну русла источника появляется тонкий зеленый налет (Зона I). Доминирует цианобактерия Phormidium angustissimum. В меньшем количестве встречются цианобактерии Anabaena contorta и Synechococcus lividus и аноксигенная фототрофная бактерия Chloroflexus aurantiacus (таб.3). Из проб мата была выделена культура сульфатредуцирующей бактерии. По краям мата, выступающим над поверхностью воды, происходит выпадение карбоната кальция.

При температуре 54-45°С и рН 8.4 развивается желто-зеленый двуслойный мат толщиной до 1 см (Зона II). На участках не покрытых термальными водами поверхность мата желто-зеленая. Верхний желто-зеленый слой пронизан газовыми полостями с доминированием Phormidium angustissimum (рис. 2г). В нижнем темно-зеленом слое также доминирует Phormidium angustissimum, в меньшем количестве встречаются Anabaena contorta, Anabaena minutissima, Synechococcus lividus и нитчатые зеленые бактерии Chloroflexus aurantiacus. На участках мата покрытых термальными водами поверхность мата темно-зеленая. Видовой состав аналогичен, хотя доминирует цианобактерия Anabaena contorta (рис 2д). На участках мата периодически подвергающихся воздействию более высокой температуры в поверхностных слоях мата отмечается большое количество пустых чехлов нитчатых цианобактерий рода Phormidium (температура поверхностных слоев может доходить до 65°С, тогда как температура внутри мата составляет 50-35°С). Из проб микробных матов зоны II был выделен штамм аноксигенной фототрофной бактерии Chloroflexus aurantiacus. На выступающих над поверхностью мата участках выпадает карбонат кальция. Площадь литифицированных участков в разные годы различается. Можно предположить, что с течением времени площадь литифицированных участков увеличивается и они сливаются в сплошную поверхность. Затем, при сдвиге русла источника, по литифицированной поверхности происходит образование нового микробного мата.

При температуре 44-30°С и рН 8.8 развивается двуслойный мат толщиной до 5 мм (Зона III). Поверхность мата ярко оранжевого цвета, в ней доминируют Phormidium angustissimum и Anabaena minutissima. Толща мата светло-зеленого цвета. В ней встречается Chloroflexus aurantiacus. В этой зоне наибольшее видовое разнообразие цианобактерий. Встречаются также Phormidium valderie f. tenue, Phormidiun molle, Oscillatoria tambi f. uralescens, Lyngbia aestuarii, Anabaena contorta, Gloeocapsa minuta и Microcystis pulverea. Из проб микробных матов был выделен штамм аноксигенной фототрофной бактерии Chloroflexus aurantiacus. На выступающих над поверхностью мата участках выпадает карбонат кальция.