Статья: Связь интегрального биохимического индекса и содержания хлорорганических ксенобиотиков в печени морского ерша Scorpaena porcus Linnaeus, 1758 в севастопольской морской акватории

Отклик организмов рыб на загрязненность окружающей среды определяли по изменению биохимических параметров печени: концентрации альбумина (Алб), активности холинэстеразы (ХЭ), показателей проокси- дантно-антиоксидантной системы (активность каталазы (Кат), уровень окислительной модификации белков (ОМБ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ)).

Образцы ткани печени несколько раз промывали холодным физраствором, гомогенизировали, центрифугировали в лабораторной рефрижераторной центрифуге MPW-352R (Польша) 15 мин с ускорением 10000 g. Для дальнейшего анализа использовали супернатант.

Концентрацию альбумина определяли с применением стандартного набора реагентов «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ» (Россия). Активность ХЭ анализировали с помощью ацетилхолинхлорида в качестве субстрата (Каталог инструкций, 2005). Активность Кат регистрировали по реакции взаимодействия перекиси водорода с молибдатом аммония (Королюк и др., 1988). Уровень ОМБ выявляли по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-ди- нитрофенилгидразином. Оптическую плотность образовавшихся 2,4-динитрофенил- гидразонов регистрировали при следующих длинах волн: 346 и 370 нм (альдегидные и кетонные продукты окислительной модификации нейтрального характера), 430 нм (альдегидные продукты окислительной модификации основного характера) (Дубинина и др., 1995). Для расчета интегрального биохимического индекса (ИБХИ) использовали суммарное значение трех показателей ОМБ. Уровень ПОЛ регистрировали по реакции с тиобар- битуровой кислотой (Стальная, Гаришвили, 1977). Биохимические показатели пересчитывали на белок сырой массы ткани, концентрацию которого определяли с использованием стандартного набора реагентов «ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ». Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000 (Россия).

Для оценки ИБХИ проводили расчеты, представленные в (Beliaeff, Burgeot, 2002), в которых использовали среднее значение биомаркеров (X) на станции, среднее значение по всей выборке данных (m), его стандартное квадратичное отклонение (s), параметр Y= (Х - m)/s, который представляет собой стандартизированное среднее Х, параметр Z, равный Y или -Y, если биологический эффект соответственно активировался или ингибировался, минимальное значение для каждого биомаркера для всех станций (min) и значение S, рассчитанное как S = Z + |min|.

ИБХИ определяли по площади многоугольников, полученных на лепестковых диаграммах. Пример диаграммы ИБХИ для печени ершей из бухты Александровской показан на рис. 1.

Площадь пятиугольника АБВГД, очерченного на диаграмме, где на радиальных осях отложены стандартизованные значения биохимических маркеров S, рассчитывали по формуле (1) как сумму площадей (А) пяти треугольников, с общей вершиной в точке 0:

Площади треугольников рассчитаны через две стороны, которыми являются показатели биохимического отклика S и синус угла между ними, равного 2п/5. Приведем пример расчета площади АА0Б:

Достоверность различий уровней концентрации ХОС оценена с помощью U-критерия Манна-Уитни. Статистическая надежность уравнений нелинейной регрессии оценена с помощью F-статистики распределения Фишера. Оценку значимости коэффициента корреляционной связи (r) концентрации ХОС в печени ершей, донных отложений и ИБХИ проводили с использованием /-критерия Стьюдента. Статистическая обработка и графическое оформление полученных результатов выполнены с помощью пакета прикладных программ R, MS Excel 2016, «Гидролог» (Belokopytov, 1998).

Результаты

В донных отложениях во всех районах обнаружены следующие пять индикаторных конгенеров ПХБ: 52, 101, 138, 153 и 180. В бухтах Александровская и Стрелецкая, которые наиболее подвержены антропогенному прессу, донные отложения были представлены илами, концентрация ЕПХБ5 в них составила в среднем 110 и 121, а ЕДДТ - 35 и 51 нг/г соответственно. В бухте Балаклавской содержание ЕПХБ5 в грунтах равнялось 59, ЕДДТ - 36 нг/г. В Казачьей бухте в районе вылова ершей дно образовано крупной заиленной галькой, где загрязняющие вещества группы ДДТ не накапливались, концентрация ПХБ по сравнению с другими исследованными бухтами была минимальной - 9 нг/г (рис. 2).

Рис. 1. Лепестковая диаграмма биохимических маркеров из бухты Александровской. Кат - активность каталазы, Алб - содержание альбумина, ХЭ - активность холинэстеразы, ПОЛ - уровень перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков (ОМБ)

Fig. 1. A biomarker radar chart for the station in Alexandrovskaya Bay. Cat: catalase activity, Alb: albumin content, ChE: cholinesterase activity, LP: lipid peroxidation, OP: level of oxidized proteins

Акватории Любимовки и бухты Ласпи относятся к открытым прибрежным участкам моря, где гру нт состоит в основном из песка, слабо сорбирующего гидрофобные загрязняющие вещества. Содержание ЕПХБ5 в этих районах было меньше, чем в бухтах, и составляло 4 и 6 нг/г соответственно, а концентрация ЕДДТ была практически равной - 1 нг/г.

Показатель жирности печени рыб изменялся в интервале от 13 до 32%, в среднем составил 24 ± 6% на сырую массу (результаты представлены в виде среднее значение ± стандартное отклонение, табл. 2). Достоверной разницы показателей жирности печени ерша между бухтами и открытыми районами не выявлено.

Во всех пробах печени обнаружены шесть индикаторных конгенеров ПХБ, а также метаболиты ДДТ: ДДЭ и ДДД (кроме бухты Казачьей, где ДДД не обнаружен).

Рис. 2. Средняя концентрация ХОС в донных отложениях в районах отлова морского ерша в севастопольской морской акватории в 2016-2017 гг. (Малахова и др., 2018) и в 2018 г.

Fig. 2. Mean OC concentration in the bottom sediments at scorpion fish catch stations in the Sevastopol marine area in 2016-2017 (Malakhova et al., 2018) and in 2018

В 83% образцов определен также исходный пестицид ДДТ. Анализ содержания ХОС показал многократные достоверные различия (р<0,05) между исследованными станциями (табл. 2). Наиболее высокая концентрация пестицидов группы ДДТ определена в бухтах Балаклавской и Стрелецкой, наименьшая - в бухте Казачья.

Несмотря на более чем сорокапятилетний запрет применения ДДТ, соединения этой группы составляли от 7 до 45% в сумме концентрации обнаруженных ХОС.

Таблица 2. Среднее содержание липидов (+/- СКО,% сырой массы), средняя концентрация п,п'-ДДТ и его метаболитов п,п'-ДДЭ и п,п'-ДДД и конгенеров ПХБ (+/- СКО, нг/г сырой массы) в печени ерша Scorpaena porcus в бухтах и открытых районах морской акватории Севастополя

Table 2. Mean fat content (+/- SD,% wet weight), mean concentration of p,p'-DDT and its metabolites p,p'- DDE and p,p'-DDD and of six PCB congeners (+/- SD, ng/g wet weight) in the liver of Scorpaena porcus from Sevastopol bays and the offshore area

Обозначение: н.обн. - не обнаружено.

Максимальное относительное количество ЈДДТ обнаружено у ершей в бухте Ласпи, где общий уровень содержания ХОС в печени был наименьшим, минимальное - в бухте Казачьей.

Преобладающим метаболитом ДДТ в пробах печени ерша был ДДЭ, содержание которого в ЈДДТ составляло в среднем 89%, что свидетельствовало о том, что исходный пестицид ДДТ в последнее время не поступал в организмы ерша. Однако в пробах наблюдалось некоторое остаточное количество ДДТ, так как метаболизм ранее накопившегося пестицида не успел пройти полностью, поскольку время полного исчезновения ДДТ для различных климатических зон, а также в зависимости от природы матрицы, где он был аккумулирован, составляет от 240 до 3850 сут. (Исидоров, 1999).

В полузакрытых севастопольских бухтах и акватории Любимовки основная доля обнаруженных ХОС в печени ерша была представлена ПХБ, концентрация суммы которых в среднем в 8,8 и 3,4 раза соответственно превышала содержание суммы ДДТ и его метаболитов. В бухте Ласпи такого превышения промышленных токсикантов над загрязнителями сельскохозяйственного назначения не наблюдали. Максимальное содержание ЕПХБ6, составляющее в среднем 2044 и 2019 нг/г, обнаружено в печени ершей в бухтах Александровской и Стрелецкой, минимальное - 139 нг/г - в бухте Ласпи (табл. 2).

Доминирующими конгенерами в пробах печени ерша были гексахлорбифенилы 138 и 153 (рис. 3). Максимальное относительное содержание ПХБ 138 и 153 определено в бухте Казачьей, 40 и 43% соответственно, минимальное - в бухте Ласпи, равное 14 и 25% соответственно.

Суммарное содержание ЈПХБ6 и ЈДДТ не превышало нормативов, установленных в России для печени рыбы, составляло 5000 и 3000 нг/г сырой массы соответственно (Гигиенические требования ..., 2002).

Сравнительный анализ молекулярных биомаркеров показал, что активность каталазы, содержание альбумина, уровень ОМБ и ПОЛ в печени рыб из бухт Александровской и Стрелецкой превышали соответствующие значения в других акваториях. Напротив, активность холинэстеразы в этих наиболее загрязненных районах была в 1,5 раза ниже, чем в более чистой бухте Ласпи и акватории Любимовки (табл. 3).

Для значений ИБХИ, рассчитанного на основании статистических параметров биохимических маркеров в печени рыб, наблюдались очевидные различия между исследованными районами. В Александровской и Стрелецкой бухтах он был многократно выше, чем в других районах, и составлял 10,87 и 13,03 соответственно. Минимальный индекс, равный 0,01, определен в бухте Ласпи (рис. 4). В целом значения ИБХИ ранжировались по убыванию в ряду: Стрелецкая бухта > Александровская бухта >> Балаклавская бухта > Казачья бухта >> акватория Любимовки >> бухта Ласпи.

Обсуждение результатов

Степень загрязнения донных отложений ХОС изучается во многих районах Мирового океана. Сравнение результатов, полученных в настоящей работе, с литературными данными по уровню содержания ХОС в морях средиземноморского бассейна показало (табл. 4), что концентрации ПХБ в донных осадках полузакрытых бухт Севастополя сопостави- мы со значениями, обнаруженными в подверженных интенсивному промышленному воздействию бухтах и заливах на юге Испании (Fernandes et al., 2002) и в Адриатическом море (Nuro et al., 2009), но были ниже, чем максимальные значения загрязнения ПХБ в проливе Босфор (Okay et al., 2009) и на юге Франции (Kanzari et al., 2012). Сравнение диапазонов концентрации ЈДДТ выявило, что уровень загрязненности донных отложений в севастопольской акватории был выше, чем в канале Берри на юге Франции (Kanzari et al., 2012), но несколько ниже, чем в других районах Средиземного моря (Fernandes et al., 2002; Qu et al., 2018; Barakat et al., 2013) (табл. 4).

Fig. 3. Proportions of PCB congeners (%) in the liver of the black scorpion fish

Таблица 3. Статистические параметры молекулярных биомаркеров для печени морского ерша Scorpaena porcus из различных по загрязненности морских районов Севастополя

Table 3. Statistical parameters of molecular biomarkers of the liver of black scorpionfish Scorpaena porcus from differently-polluted sea areas near Sevastopol