Материал: ВЭЖХ-лабораторная

Практическая работа 2.4. Ознакомление с конструкцией, приобретение навыков эксплуатации жидкостного хроматографа «Милихром А-02» и получение спектров ароматических соединений

Цель и содержание работы

Ознакомиться с основными блоками и схемой работы хроматографа «Милихром А-02», программой, управляющей настройками, сбором и записью данных. Записать хроматограмму смеси стандартных веществ и получить информацию об имеющихся пиках веществ и их количественных характеристиках с использованием программы обрабатывающей «МультиХром». Ознакомиться с работой спектрофотометрического детектора в сочетании жидкостной хроматографией, и получить представление о его информативности для идентификации органических веществ, на примере установления структуры полиароматических углеводородов путем анализа их спектральных соотношений. Освоить один из базовых методов определения концентрации веществ в хроматографии, а именно метод абсолютной калибровки. Определить концентрацию эталонного вещества - нафталина в растворе ацетонитрила данным методом.

Краткие теоретические сведения

Технические характеристики прибора: Хроматограф «Милихром А-02» является микроколоночным высокоэффективным прибором, оснащенным градиентной системой элюирования, автоматическим вводом пробы и спектрофотометрическим детектором. Он выполнен в виде портативного прибора и может использоваться в составе любых аналитических лабораторий, в том числе в составе подвижных (например, на водных судах).

Основные компоненты включают:

• двухкомпонентный градиентный насос шприцевого типа, который через шестипортовый двухходовой кран соединяется либо с резервуарами для элюентов А и В, либо со входами смесителя элюентов. В линии насоса А установлен датчик давления, включенный через дополнительный капилляр;

• автоматический дозатор, со съемной кассетой на 46 проб. На нем смонтирован узел инжекции и установлены резервуары для промывки инжекционной иглы и гнездо для слива элюента через иглу;

• подвижная инжекционная игла, для набора пробы, нанесения ее на колонку;

• хроматографическая колонка, помещенная в термостат, в котором нагревательным элементом и термометром служит прецизионная медная обмотка;

• спектрофотометрический детектор УФ - диапазона (190-360 нм).

В ВЭЖХ наиболее универсальным является спектрофотометрический детектор, измеряющий оптическую плотность элюата, вытекающего из колонки и проходящего через проточную кювету, при одной или нескольких длинах волн света. Оптическая плотность А вещества прямо пропорциональна высоте или площади хроматографического пика. Зависимость оптической плотности А от длины волны падающего на кювету с веществом света в диапазоне длин волн от 190-360 нм (сплошное излучение дейтериевой лампы) называется ультрафиолетовым спектром поглощения. УФ-спектры индивидуальны для каждого вещества, однако широкие полосы поглощения снижают их информативность для идентификации. Тем не менее, получение УФ-спектров веществ разделяемой смеси необходимо для определения оптимальной длины волны анализа, что позволяет значительно поднять порог обнаружения веществ.

Среди спектрофотометрических детекторов наибольшее распространение получили сканирующие УФ - спектрофотометры с быстрым циклическим переключением нескольких длин волн в процессе хроматографирования и с возможностью записи спектра в режиме остановки потока подвижной фазы. На одноволновой хроматограмме идентификация пика осуществляется только путем сравнения его времени удерживания с временем удерживания пика стандарта. Если хроматограмму записали на нескольких длинах волн одновременно, то каждому веществу на хроматограмме соответствует несколько пиков, записанных при разных длинах волн, и в качестве критерия идентификации можно использовать еще и соотношения площадей этих пиков (спектральные соотношения).

Для определения концентрации вещества в пробе необходимо выполнить калибровку - установление количественной зависимости площади пика от концентрации. В методе абсолютной калибровки из стандарта анализируемого веществ готовят ряд растворов с известными концентрациями, перекрывающими ожидаемый диапазон содержания в пробе. Далее эти растворы последовательно хроматографируют в одинаковых условиях и получают площади пиков, соответствующие концентрациям калибровочных растворов. На основании этих данных строят калибровочный график, обсчитываемый методом наименьших квадратов по линейной регрессии. Полученное уравнение зависимости концентрации от площади пика используется для расчета концентрации анализируемого вещества в пробах.

Материалы и оборудование:

- хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром А-02"; колонка Ø2х75 мм с обращенно-фазным сорбентом ProntoSIL 120-5C18 AQ # 1410;

- пипетки-дозаторы переменного объема 10÷100 мкл,

- стеклянные микропробирки с пробками на 50 мкл,

- ацетонитрил чистоты «для ВЭЖХ»,

- раствор веществ-стандартов (3 полиароматических углеводорода (ПАУ) в ацетонитриле)

- нафталин химически чистый,

- мерные колбы объемом 5 или 10 мл.

Ход работы:

1. На компьютере запустить управляющую программу МИЛИХРОМ. Включить хроматограф. После включения проходит процесс самотестирования – автоматическая проверка работоспособности всех блоков. Ход тестирования отображается в специальном статусном окне. После полного прохождения теста в статусной строке основного окна появляется надпись ГОТОВ;

2. Убедиться, что резервуары для элюентов наполнены 100%ным ацетонитрилом. Погрузить капилляры насосов А и В в резервуары с элюентами. После опускания фильтра в сосуд аккуратно встряхнуть фильтр и сосуд для удаления воздушных пузырьков с поверхности фильтра;

3. Открыть меню Управление →Ручные операции…

4. Установить температуру анализа : 35°С;

5. Провести процедуру смены растворителей для обоих насосов;

6. Провести процедуру промывки иглы. Емкости с моющими растворами (обычно метанол и/или дистиллированная вода) устанавливаются в специальные гнезда на автодозаторе.

7. Провести процедуру промывки инжекционного порта. Необходимо задать: объем элюента – 100 мкл; концентрацию элюента (ацетонитрил) – 50%; скорость потока подвижной фазы 200 мкл/мин;

8. Провести регенерацию колонки. Данная процедура необходима для удаления пузырьков воздуха из колонки, которые могут возникнуть в гидравлической системе и колонке, пребывавшей без давления. В диалоговом окне задать параметры регенерации:

Объем элюента – 500 мкл

Концентрация элюента (ацетонитрила) – 50%

Скорость потока – 200 мкл/мин

Постоянная времени – 0,34 с

Длина волны 1 – 210 нм

Длина волны 2 – 360 нм

Хроматограф готов к работе.

9. Проверить правильность установок параметров анализа в меню Параметры/Конфигурация анализа:

• Промывка иглы – вкл.; Промывка инжектора - вкл.; Объем буфера 5 мкл – откл. Фиксированная скорость потока – вкл. Мин. давление 0.0 МПа, Макс. давление – 7.0 МПа; Метод однолучевой; Режим нормальный; Кювета верхняя.

10. Провести хроматографирование смеси трех стандартных веществ (ПАУ), выданной преподавателем. Запуск хроматограммы производить в меню Управление/Анализ; на экране появится диалоговое окно хроматографического метода:

• В поле Автодозатор указать номер расположения пробирки с пробой в каретке и набираемый объем: №1 и 2 мкл.

• В таблице Детектора: постоянная времени – 0,18 с; длина волны 250 нм.

• В таблице Градиента: поток – 150 мкл/мин; регенерация – 0 мкл 50%, шаг 0 – 0 мкл 50% Б; шаг 1 – 550 мкл 50% Б.

• В поле Описание/образец указать оператора, описать пробу (н-р, смесь стандартов ПАУ).

• Сохранить настройки анализа, выбрав Сохранить как, и задать номер подгруппы студентов (на латинице).

• В пробирку налить 30 мкл анализируемой смеси, закрыть пробкой, установить в соответствующую позицию автосамплера.

• запустить анализ - СТАРТ.

• После окончания анализа данные автоматически запишутся в файлы с расширением *. chr в директории M-CHROM\DATA\имя анализа.

11. Через меню Обработка/Обработать данные или через иконку запустить обрабатывающую программу «МультиХром».

• Убедиться, что размечено только три пика веществ-стандартов; убрать (если имеются) "грязевые" пики, открыв диалоговое окно через меню Обработка/переразметить, и подобрав минимальную высоту пика (н-р 0.02 AU).

• Открыть диалоговое окно Опции отчета через меню Обработка/Выдать отчет.

• В поле Метод расчета выбрать позицию Custom (Заказной).

• Щелкнуть по кнопке << Столбцы.

• В левой части окна выбрать столбцы, которые будут включены в таблицу пиков: номер пика, время выхода, высота, площадь.

• Затем из поля Разделы отчета убрать избыточную информацию - колонка, элюент (убрать галочки).

• Просмотреть общий вид отчета (кнопка Просмотр).

• Напечатать отчет, щелкнув по кнопке Отчет.

Выполнение спектрофотометрической идентификации веществ.

12. Повторно запустить анализ смеси стандартных ПАУ (см.пункт 10).

13. В процессе хроматографии, когда через фотометрическую ячейку протекает чистый элюат, необходимо сделать ПАУЗУ (кнопка PAUSE в меню) и запустить сканирование спектра нулевой линии: Управление\ Спектр\Нулевая Линия. Полученный спектр будет запомнен и, впоследствии, будет вычитаться из всех последующих спектров. Таким образом, будут сниматься спектры чистых пиков, без вклада спектра растворителя. Затем продолжить процесс хроматографирования, отжав кнопку меню RESUME.

14. При выходе каждого из трех веществ-стандартов ПАУ, сделать ПАУЗУ в точке наиболее близкой к вершине пика. В меню выбрать Управление\ Спектр, нажать СТАРТ - запустить сканирование спектра. Спектр отображается на экране в специальном окне и затем, после остановки сканирования - автоматически записывается в файл с расширением*.spm, размещается в той же поддиректории, что и файл хроматограммы. Продолжать хроматографирование после каждого останова.

15. Распечатать спектры: в меню Милихром А-02 Файл\Открыть выбрать файлы с расширением .spm, затем Файл\Печать. По каждому из трех полученных спектров определить оптимальные для анализа длины волн (волну, на которой поглощение света максимально).

16. Записать хроматограмму стандартной смеси еще раз в тех же условиях, но указав в таблице Детектора три выбранные длины волн. Обсудить вид хроматограммы, и различия в площадях пиков, записанных на разных длинах волн одновременно.

17. Для расчета спектральных соотношений для идентификации пиков веществ смеси записать хроматограмму в тех же условиях, указав в таблице Детектора длины волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм.

18. В программе «МультиХром» загрузить полученную хроматограмму Файл\Импортировать\Хроматограмму. Выдать и распечатать краткий отчет (см. п. 11) для первой длины волны. Далее для переключения волн выбрать в меню Метод\Настройка каналов. Щелкнуть в открывшемся окне на нужной длине волны, переместить ее стрелкой в верхний ряд таблицы, нажать Применить. Распечатать отчеты для остальных длин волн (см. выше).

19. Рассчитать спектральные соотношения площадей каждого пика на каждой из длин волн, отнесенные к площадям при длине волны λ=210 нм. Сравнить полученные спектральные соотношения, с таковыми в базе данных, выданной преподавателем, на этом основании проидентифицировать вещества. Результаты представить в виде таблицы в тетради, включающей имя каждого компонента, объем удерживания, и его спектральные соотношения.

Выполнение количественного анализа: абсолютная калибровка

18. Приготовить растворы нафталина в ацетонитриле трех концентраций: С₁ = 5 мг/мл, С₂= 2.5 мг/мл, С₃=1 мг/мл.

Процедура приготовления растворов для калибровки: провести взвешивание вещества и приготовить раствор с максимальной концентрацией, затем рассчитать объем аликвот для растворов с меньшими концентрациями и приготовить их методом разведений.

18. Единой серией записать 3 хроматограммы с различной концентрацией нафталина в ацетонитриле, задав следующие условия хроматографического процесса:

• В поле Автодозатор указать для каждой пробы (всего 3) ее номер в каретке и объем – 1 мкл;

• В таблице Детектора: постоянная времени – 0,18 с; длина волны 250 нм;

• В таблице Градиента: поток – 150 мкл/мин; регенерация – 0 мкл 50%, шаг 0 – 0 мкл 50% Б; шаг 1 – 400 мкл 50% Б;

• В поле Описание/образец указать оператора, описать серию пробы -концентрации нафталина.

• Сохранить настройки анализа, выбрав Сохранить как…

• В пробирки налить по 50 мкл анализируемых смесей, закрыть пробками, установить в соответствующие позиции автосамплера.

• СТАРТ запустить анализ.