Автореферат
Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Специальность 03.03.01 физиология
Возрастные особенности синаптической активации клеток Пуркинье мозжечка системой лазящих и мшистых волокон
Карелина Татьяна Викторовна
Санкт-Петербург- 2010
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем нейрофизиологии, и эволюционной нейрофизиологии в частности является изучение контроля, регуляции и координации движений. Мозжечок вовлечен в общий контроль движений вместе пирамидной и экстрапирамидной системами в отношении таких важных функций как плавность, точность и быстрота движений (Карамян, 1976; Разумеев, Григорьян, 1976, Толкунов Б.Ф. 1978). Он также участвует в механизмах предварительного программирования движений (Фанарджан, Григорьян, 1983; Ito, 1984). Между тем, своеобразие анатомической иннервации клеток Пуркинье и цитоархитектоники коры мозжечка, сходное у всех представителей позвоночных, делают мозжечок весьма удобным и привлекательным объектом для функционального изучения. Двойственный характер иннервации клеток Пуркинье системами мшистых и лазящих волокон (Ramon y Cajal, 1888; Eccles et all, 1967; Андреева, Обухов, 1999) позволяет успешно идентифицировать клетки Пуркинье в ходе проведения электрофизиологических исследований и оценивать эффективность синаптического действия, оказываемого этими афферентными системами на клетки Пуркинье.
Гармалин широко используется в исследованиях, связанных с физиологией клеток Пуркинье мозжечка. Это основано на том, что он является специфическим активатором нейронов ядер нижней оливы, аксоны которых формируют одну из важных афферентных систем мозжечка - систему лазящих волокон (Eccles et all, 1967; Ito, 1984; Miwa, 2000). Другим важным инструментом воздействия на афферентный вход к клеткам Пуркинье является этанол, который оказывает растормаживающий эффект на активность клеток Пуркинье мозжечка, активируемых системой мшистых волокон (Григорьян, Исмаилов, 1984). В то же время этанол вызывает подавление тремора, вызванного введением гармалина (Rappaport et all, 1984). Эти данные подтверждены тем, что при поступлении этанола в организм его наибольшая концентрация в пределах ЦНС обнаруживается именно в мозжечке и гиппокампе (Сытинский, 1980).
Наиболее адекватным в изучении механизмов контроля и регуляции движения является исследования в онтогенетическом плане, так как одним из путей решения задач эволюционной физиологии является сравнительно-онтогенетический метод (Орбели, 1961). Следует отметить, что роль мозжечка и его главного элемента - клеток Пуркинье - в контроле и регуляции движений в онтогенезе является одной из слабо разработанных разделов физиологии двигательного аппарата. Экспериментальный материал, выполненный на взрослых животных, довольно широко представлен в периодической литературе (Armstrong, Edgley, 1988; McDevitt, 1982; Свенсон, 2005), а возрастной аспект физиологии клеток Пуркинье с параллельным изучением двигательных реакций на незрелорождающихся животных освещен крайне скудно. Научный интерес к этой теме диктуется еще и тем соображением, что незрелорождающиеся крысы значительно отличаются по темпам постнатального развития электрофизиологической картины разряда клеток Пуркинье от зрелорождающихся, в частности морских свинок, на различных стадиях развития (Тарасова, Григорьян, 1984; Григорьянн и др. 2003). Старение, являясь заключительным этапом онтогенетического развития, так же как и ранний период постнатальной жизни, включает изменения функциональной активности всех систем организма (Анисимов, 2003; McKay, Turner R, 2005).
С учетом сказанного, систематическое изучение эффективности синаптического действия двух основных афферентных входов к клеткам Пуркинье мозжечка, вовлеченных в контроль и регуляцию движений, представляется актуальным. Сочетание электрофизиологического метода исследования функционального состояния клеток Пуркинье мозжечка, активируемых системой лазящих и мшистых волокон у животных, находящихся на разных этапах онтогенеза, а именно на стадии морфо-функционального созревания клеточных элементов коры мозжечка (двухнедельные крысята), зрелой стадии развития (3-6 мес) и в процессе старения (25-36 мес) с изучением уровня двигательной активности является наиболее адекватным подходом в решении данной проблемы, который углубит наше понимание сложных механизмов контроля, координации и регуляции движений.
Цель работы
Изучить особенности синаптической активации клеток Пуркинье мозжечка афферентами лазящих и мшистых волокон и ее связь с развитием моторной активности крыс на разных стадиях постнатального онтогенеза.
Задачи исследования
1. Определить исходные численные показатели частотного спектра активности клеток Пуркинье, активируемых системами лазящих и мшистых волокон, параметров сложного спайка и длительности депрессии простых спайков после сложного разряда у крыс, находящихся на разных этапах онтогенеза.
2. Сравнить возрастные изменения частотного спектра клеток Пуркинье мозжечка, формы сложного спайка и длительности депрессии простых спайков с уровнем моторной активности крыс под влиянием гармалина.
3. Сравнить возрастные изменения частотного спектра клеток Пуркинье мозжечка, формы сложного спайка и длительности депрессии простых спайков с уровнем моторной активности крыс под влиянием этанола.
Научная новизна работы
Новизна работы заключается в том, что в ней впервые дан сравнительный анализ паттерна активности клеток Пуркинье мозжечка у представителя незрелорождающихся животных - крыс линии Вистар на разных стадиях онтогенеза, отражающих незрелый уровень развития клеточных элементов и синаптических связей в коре мозжечка, взрослую половозрелую стадию и старческие изменения. В работе впервые продемонстрирована различная чувствительность клеток Пуркинье мозжечка животных, находящихся на разных стадиях онтогенетического развития к введению гармалина и этанола.
В работе впервые установлено, что форма сложного спайка в разряде клеток Пуркинье мозжечка двухнедельных крыс уже соответствует взрослой стадии развития, а на поздней стадии онтогенеза наблюдаются ее инволюционные изменения. Кроме того, впервые показано, изменения формы сложного спайка под влиянием гармалина и этанола коррелируют с длительностью депрессией простых спайков.
Наконец, новым в работе является сопоставление полученных изменений паттерна активности клеток Пуркинье мозжечка и формы сложного спайка с уровнем развития двигательной активности в соответствующих возрастных группах у интактных животных и под влиянием гармалина и этанола.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В процессе созревания и старения у представителей незрелорождающихся животных - крыс линии Вистар наблюдаются изменения частотного спектра активности клеток Пуркинье мозжечка, которые сопровождаются изменением уровня моторной активности как интактных животных, так и в условиях действия гармалина и этанола.
2. Форма сложного спайка у двухнедельных крысят соответствует взрослой, половозрелой стадии развития, в то время как у старых животных она существенно отличается от взрослых особей. Введение как гармалина, так и этанола изменяет форму сложного спайка, которое сопровождается изменением длительности депрессии у животных всех возрастных групп.
Научное и практическое значение работы.
В работе проведен анализ функционального состояния клеток Пуркинье мозжечка крыс, активируемых афферентами лазящих и мшистых волокон, показывающий разную степень зрелости возбудительно-тормозных процессов в коре мозжечка. Полученные данные расширяют теоретические представления о механизмах управления двигательной активностью животных на разных этапах онтогенеза. Полученные в работе экспериментальные данные о влиянии гармалина на активность клеток Пуркинье могут быть использованы в качестве теоретического обоснования для объяснения механизмов возникновения и развития эссенциального тремора у людей. Материалы с влиянием этанола на афферентную систему мшистых волокон послужат углублению понимания механизмов нарушения позы и походки в начальных стадиях алкогольной интоксикации.
Кроме того, полученные результаты могут быть использованы в курсах лекций по физиологии центральной нервной системы для студентов биологических факультетов высших учебных заведений и медицинских педиатрических академий и университетов. Материалы диссертации могут также войти в руководства по общей физиологии ЦНС.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы докладывались на международном симпозиуме, посвященном позе и походке (Япония, Матсумото, 1994); на заседании лаборатории физиологии движений Рокфелеровского университета США (1996); на семинаре лаборатории физиологии ЦНС неврологического института Р.С. Дау (США, Портленд, 1996); на XXXIII международном Конгрессе физиологических наук (С-Петербург, 1997); на ежегодных собраниях Американского общества нейронаук: 30th Annual Meeting of American for Neurocsience (New Orleans, 2000), 31th Annual Meeting of American for Neurocsience (San Diego, 2001), 32th Annual Meeting of American for Neurocsience (Orlando, 2002); на заседания Санкт-Петербургского общества физиологов в 2000 и 2001 годах, на Совещаниях и школах по эволюционной физиологии (1996, 2001, 2006); на конференции «Научное наследие академика Л. А.Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиологии экстремальных состояний» (2008); на VII Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 160-летию со дня рождения И.П.Павлова «Механизмы функционирования висцеральных систем» (2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 8 статей, из них 4 в реферируемых журналах и 18 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики и объектов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, содержащего 207 источников. Материал диссертации изложен на 125 страницах, иллюстрирован 22 рисунками и 5 таблицами.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 197 крысах, самцах линии Вистар. Все экспериментальные животные были разделены на три возрастные группы. В первую группу входили двухнедельные крысята (13-14 суток), во вторую группу - взрослые животные (3-6 месяцев) и в третью группу - старые животные (25-36 мес.).
Анестезия и хирургические процедуры. Крыс внутрибрюшинно наркотизировали уретаном в дозе 1000-1400 мг/кг массы тела. С целью уменьшения пульсации поверхности мозжечка во время дыхания в Т-образный разрез на трахее вводили трахеотомическую трубку, которую закрепляли с помощью лигатуры. Трепанационное отверстие на затылочной кости черепа находилось в 1-2 мм от среднесагиттальной линии черепа, над зоной HV-HVI долек по классификации Ларселла (Larsell, 1934). После проведения операции животное закреплялось в стереотаксическом аппарате, где голова жестко фиксировалась с помощью ушных держателей. В течение всего времени проведения операционных процедур, а также во время опыта животные находились на термостатическом столике, где поддерживалась постоянная температура 38єС. После того как микроэлектрод касался коры мозжечка, отверстие в затылочной кости черепа заливалось 6% раствором агар-агара для предотвращения пульсации, связанной с дыхательной и сердечной деятельностью, а также, во избежание подсыхания коры мозжечка. Все опыты проведены в соответствии с принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996).
Метод регистрации и идентификации клеток Пуркинье. Внеклеточное отведение активности клеток Пуркинье осуществляли стеклянными микроэлектродами, заполненными 2, 5М раствором NaCl с сопротивлением кончика от 2 до 10 мОм. Индифферентный электрод вкалывался в черепную кость. Усиленный сигнал подавался на экран осциллографа для визуального контроля. В серии экспериментов, связанных с оценкой влияния гармалина на паттерн активности клеток Пуркинье мозжечка, сигнал от усилителя регистрировался на магнитофон. Записи на магнитной ленте через преобразователь импульсов вводились в электронно-вычислительную машину «Электроника Д3-28» с целью получения цифровых характеристик импульсной активности клеток Пуркинье. В других сериях экспериментов, связанных с оценкой формы сложного спайка и влияния этанола на импульсную активность клеток Пуркинье, сигнал от усилителя нейронной активности подавался на аналогово-цифровую плату L-791, где он оцифровывался с частотой дискретизации 10 КГц. Идентификация клеток Пуркинье осуществлялась по одновременному наличию простых и сложных спайков в разряде регистрируемой клетки, отражающих синаптическую активацию клеток Пуркинье системами мшистых и лазящих волокон соответственно, а также по наличию депрессии простых спайков после сложного разряда. В серии опытов с введением гармалина и этанола после 10-ти минутной регистрации фоновой активности проводилось медленное внутрибрюшинное введение гармалина (фирма Sigma) из расчета 15 мг/кг или этанола в дозе 2г/кг в виде 30% раствора во всех возрастных группах, после чего продолжалась регистрация активности той же клетки Пуркинье в течение 60 мин.