Изменение длительности депрессии простых спайков, наблюдаемой вслед за возникновением сложного спайка, во всех трех возрастных группах животных начиналось одновременно с изменением частоты простых спайков. Данное явление у крысят начиналось через 5 мин, у взрослых животных - через 10 мин, а у старых крыс - через 40 минут после введения этанола. При этом минимальное значение данного показателя у крысят было ниже нормы на 46%, у взрослых крыс - на 68%, а у старых животных - на 32%.
При исследовании формы сложного спайка в условиях действия этанола было установлено снижение средних значений всех исследованных параметров в трех возрастных группах. При этом было отмечено, что изменение формы сложного спайка у крысят и взрослых животных в целом несколько отставало от изменений паттерна активности клеток Пуркинье, в то время как у старых крыс все показатели изменялись практически одновременно (рис.3). У крысят достоверные изменения параметров, характеризующих форму сложного спайка наблюдались через 10 и 20 мин после введения этанола. При этом максимальное снижение длительности сложного спайка составило 21%, числа потенциалов действия в сложном спайке - 12%, а частоты импульсов в сложном спайке - 20%. У взрослых животных изменение формы сложного спайка под воздействием этанола наблюдалось более длительный период времени, чем у крысят. Так, достоверные отличия в числе импульсов, входящих в состав сложного спайка, и общей длительности сложного спайка наблюдались через 30, 40 и 50 минут после введения этанола. Изменение частоты импульсов наступало несколько позднее, чем других показателей и регистрировалось через 40 и 50 минут после введения этанола. В момент наибольшего снижения длительность сложного спайка была ниже нормы на 50%, число импульсов - на 44% и частота импульсов в составе сложного спайка - на 52%. У старых крыс изменение формы сложного спайка после введения этанола наступало позже, чем у крысят и взрослых животных и регистрировалось с40 по 60 минуту. Наибольшее снижение длительности сложного спайка составило 20%, числа импульсов в составе сложного спайка - 34%, а частоты импульсов - 23%.
В серии экспериментов с введением этанола у всех подопытных животных, независимо от возраста, наблюдалось нарушение уровня двигательной активности и шаткость походки. При оценке уровня двигательной активности было отмечено значительное снижение среднего значения данного показателя во всех возрастных группах животных. При этом следует отметить, что в отличие от гармалина, более существенное изменение двигательной активности наблюдалось у взрослых животных. Число пересеченных квадратов в этой возрастной группе был в 6, 6 раза ниже нормы, в то время как у крысят - в 3, 2 раза, а у старых животных - в 3, 5 раза.
Т.о., суммируя все вышесказанное, следует отметить, что быстрее всех на введение этанола реагировали крысята, а позже всех - старые крысы. При этом у взрослых животных достоверные изменения параметров активности клеток Пуркинье и формы сложного спайка сохранялись более длительный период времени и имели больший процент изменения по сравнению с исходным значением, чем у крысят и старых животных. Кроме того, нарушение двигательной активности под влиянием этанола было более выражено у взрослых крыс.
Обсуждение результатов
Интактные животные. В ходе проведенных электрофизиологических исследований функционального состояния клеток Пуркинье мозжечка на разных сроках постнатального онтогенеза у интактных крыс было установлено, что паттерн активности клеток Пуркинье менялся с возрастом животных. Было зарегистрировано увеличение частоты и уменьшение длительности депрессии простых спайков, тогда как частота сложных спайков оставалась практически без изменений. Полученные результаты хорошо согласуются с данными о том, что между длительностью депрессии и предшествующей ей частотой простых спайков имеется отрицательная корреляционная связь (Armstrong, Rawson, 1979). В основе наблюдаемых отличий частоты простых спайков у двухнедельных и старых крыс от взрослых животных имеет место, по всей видимости, не полная зрелость клеточных элементов и связей коры мозжечка у двухнедельных крысят (Altman 1972a; 1972b; 1972c; McKay, Turner, 2005) и регрессионные изменения, наблюдаемые в коре мозжечка старых животных (Huang et all, 1999; Dlugos., Pentney., 1994). Кроме того, полученное нами увеличение частоты и уменьшения длительности депрессии простых спайков у взрослых крыс по сравнению с двухнедельными может объясняться уменьшением длительности рефрактерного периода, следующего за возникновением спайка, которое наблюдается на начальных стадиях онтогенеза (Guan et at all, 2006). Уменьшение длительности депрессии простых спайков у старых животных по сравнению с взрослыми, возможно, связано с тем, что в процессе старения снижается плотность корзинчатых клеток (Sturrock, 1989), которые, оказывая тормозное влияние на клетки Пуркинье, вносят свой вклад в длительность депрессии простых спайков (Bloedel, 1972).
Кроме изменения самого паттерна активности клеток Пуркинье мозжечка нами было зарегистрировано и изменение формы сложного спайка в процессе старения. Не так давно было высказано предположение, что в ответе клетки Пуркинье на возбуждение, приходящее по лазящему волокну, принимает участие ВК подтип Са2+ активируемых К+ каналов (Edgerton, Reinhart, 2003), при этом экспрессия этих каналов в клетках Пуркинье мозжечка крыс достигает взрослого уровня к концу 2-й недели постнатального развития (Muller et all, 1998). Данные факты в определенной степени позволяет объяснить полученные нами результаты, когда мы не обнаружили отличий в форме сложного спайка между двухнедельными и взрослыми животными. Изменение формы сложного спайка при старении, скорее всего, опосредуется изменением концентрации Са2+ во внутриклеточной среде за счет нарушения работы Са2+ каналов на этой стадии онтогенеза (Iwamoto, 2004; Chung et all, 2001 b). Поскольку известно, что для активации ВК каналов необходим определенный уровень концентрации Са2+ в цитозоле, то его изменения, связанные с нарушениями работы Са2+ каналов, могут приводить к изменению работы ВК каналов, что, в свою очередь, может вносить свой вклад в изменение формы сложного спайка, наблюдаемое нами при старении.
Гармалин. Во всех возрастных группах увеличение уровня активации клеток Пуркинье мозжечка системой лазящих волокон за счет введения гармалина (и как следствие увеличение частоты сложных спайков) приводило либо к снижению частоты, либо к полному исчезновению простых спайков из картины разряда клеток Пуркинье. Известно, что соотношение частоты простых и сложных спайков в разряде клеток Пуркинье мозжечка носит реципрокный характер (Ferin et all, 1971; Григроьян, Тарасова, 1982). Увеличение частоты сложных спайков за счет повторной электрической стимуляции лазящих волокон приводило к снижению частоты простых спайков и их исчезновению, тогда как инактивация нижней оливы (источника лазящих волокон), наоборот, заметно повышала частоту простых спайков (Demer, 1985). В исследованиях, выполненных на целом животном и срезах мозжечка было продемонстрировано наличие спонтанной импульсной активности в деафферентированных клетках Пуркинье (Eccles et all, 1967; Raman, Bean, 1999). Это позволило сделать предположение о наличии в клетках Пуркинье внутреннего пейсмекера (Cerminara, Rawson, 2004), что может объяснить полученные нами данные о том, что у клеток Пуркинье, отнесенных ко второму типу ответов, частота простых спайков изменяется раньше чем частота сложных. Т.е. можно предположить, что хотя уровень изменения импульсации, приходящей по системе лазящих волокон, не достаточен для увеличения частоты сложных спайков, однако, возможно, что за счет влияния на внутренний пейсмекер, осуществляется снижение частоты простых спайков. У животных всех возрастных групп в наших опытах было установлено увеличение длительности депрессии простых спайков после введения гармалина. Возможно, это связано с увеличением мощности воздействия лазящих волокон, которые, с одной стороны, оказывают тормозное влияние на внутренний пейсмекер, генерирующий простые спайки, а с другой, вызывают инактивацию мембраны дендритов клеток Пуркинье за счет длительной деполяризации (Ekerot, Oscarson, 1981). Механизм действия гармалина до сих пор остается мало изученным. В опытах на мутантных мышах, у которых отсутствовали потенциал-зависимые К+ каналы (подтипы Kv3.1 или Kv3.3) было установлено, что для генерации и поддержания тремора, вызванного гармалином, необходим подтип Kv3.3, в то время как подтип Kv3.1 принимает участие в регулировании амплитуды и частоты тремора (McMahon et all, 2004).
Следует отметить, что у крысят и старых животных наблюдалось большее влияние гармалина на активность клеток Пуркинье мозжечка и форму сложного спайка по сравнению с взрослыми животными. Данное явление хорошо согласуется с литературными данными, указывающими на незрелость мозжечка в ранний период онтогенеза и инволюционные изменения, наблюдаемые в период старения, а так же меньшую лабильностью нервной системы на ранних сроках онтогенеза по сравнению с более поздними стадиями развития.
Этанол. При исследовании действия этанола на паттерн активности клеток Пуркинье мозжечка крыс всех трех возрастных групп в наших опытах отмечалось увеличение частоты и укорочение длительности депрессии простых спайков, которое сопровождалось снижением частоты сложных спайков. Полученные нами данные, с одной стороны, находятся в согласии с рядом литературных данных, указывающих на возбуждающее действие этанола, оказываемое на клети Пуркинье, активируемые системой мшистых волокон (Григорьян, Исмаилов 1987; Servais et all, 2007; Cebolla et all, 2009). С другой стороны, было показано, что в больших дозах этанол оказвывает тормозное влияние на спонтанную активность клеток Пуркинье (Eidelberg et all, 1971; Chu, 1983). Одним из мест действия этанола является оливо-мозжечковая система. Было показано, что введение этанола блокирует тремор, вызванный гармалином, при этом отмечается снижение частоты спонтанных и вызванных стимуляцией сенсорной коры сложных спайков в клетках Пуркинье мозжечка (Sinclair, 1982; Harris, Sinclair, 1984; Rappaport et all, 1984). Несколько позже было уточнено, что мишенью для этанола являются метаботропные глутаматные рецепторы, расположенные постсинаптически в синапсе лазящее волокно-клетка Пуркинье (Carta et all, 2006). Таким образом, снижение мощного активирующего действия, оказываемого на клетку Пуркинье афферентными лазящими волокнами за счет введения этанола, может привести к полученному в наших опытах увеличению частоты и уменьшению длительности депрессии простых спайков.
В серии опытов, проведенной с целью изучения влияния этанола на форму сложного спайка, было установлено снижение средних значений всех исследованных параметров. Уменьшение общей длительности и числа потенциалов действия в составе сложного спайка может быть связано с установленным фактом, что этанол влияет на позднюю фазу сложного спайка, а именно уменьшается площадь, занимаемая плато деполяризации, на котором возникают малые потенциалы действия, при этом он не влияет на начальную фазу - Na+- спайк (Carta et all, 2006). В опытах на мышах, чьи матери получали этанол во время беременности, было продемонстрировано укорочение длительностей сложного спайка и депрессии простых спайков, следующей за ним (Cebolla et all, 2009).
Полученные нами данные указывают, что из всех исследованных возрастных групп животных более сильное влияние этанол оказывал на взрослых крыс. У них достоверные изменения паттерна активности и формы сложного спайка наблюдались более длительный период времени и имели больший процент изменения по сравнению с нормой. Отчасти данный эффект этанола может быть вызван тем, что при введении одинаковых доз этанола у животных с большим весом наблюдается большая концентрация этанола в крови по сравнению с животными с меньшим весом. (Bloom et all, 1982). С другой стороны, различная чувствительность животных, находящихся на разных стадиях онтогенетического развития, вполне вероятно может определяться особенностями соотношения возбуждающих и тормозных влияний, оказываемых на клетки Пуркинье на данных стадиях онтогенеза.
Двигательная активность. Изменение паттерна активности клеток Пуркинье мозжечка и формы сложного спайка у крыс разных возрастов сопровождалось изменением уровня двигательной активности животных. Повышение ее уровня у взрослых животных по сравнению с двухнедельными крысами, по всей видимости, связано с участием зрительного анализатора в двигательной активности, которое начинает проявляться с момента открытия глаз на 15-16 сутки постнатальной жизни, что находит свое отражение в паттерне активности клеток Пуркинье мозжечка (Григорьян и др. 2003). Другие авторы показывают, что сложные локомоторные акты, требующие точной согласованности и тонкой моторной координации, появляются у крыс только после 30 суток постнатальной жизни (Petrosini. et all, 1990), что соответствует времени морфологического и функционального созревания клеток Пуркинье (McKay, Turner, 2005; Олейник, Григорьян, 1998). В проведенных нами опытах у старых крыс уровень моторной активности был значительно ниже, чем у взрослых, что сопровождалось изменением паттерна активности клеток Пуркинье и формы сложного спайка. Подобная картина прослеживается и по литературным данным. При исследовании поведенческих нарушений у старых крыс в первую очередь было отмечено постепенное снижение уровня локомоции и исследовательского поведения, тогда как нарушения координации и равновесия наблюдались в более поздний период. (Altun et all, 2007; Schulz, 2007).
Действие, как этанола, так и гармалина выражалось в снижении уровня двигательной активности крыс всех возрастов, причем в случае гармалина более сильные изменения наблюдались у крысят и старых животных, а в случае этанола - у взрослых крыс. Данные результаты совпадают с изменением паттерна активности клеток Пуркинье, когда под влиянием гармалина наиболее сильные изменения отмечались у крысят и старых животных, а в случае этанола - у взрослых крыс. Более сильное действие этанола, оказываемое на взрослых животных по сравнению с молодыми было получено и в опытах, когда исследовалось влияние этанола на координацию движений (White et all, 2002). Снижение уровня локомоторной активности под влиянием гармалина отмечается и при введении повторных доз взрослым крысам, тогда как его треморогенный эффект исчезает (Wang., Fowler, 2001).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что, наблюдаемые в процессе созревания и последующего старения изменения электрофизиологических свойств клеток Пуркинье как у интактных животных, так и в условиях действия таких веществ как гармалин и этанол сопровождаются изменением мозжечок-зависимого поведения, в частности, уровня моторной активности. Сходные результаты были получены в работах, выполненных и на ранних сроках постнатального онтогенеза как зрелорождающихся (морские свинки), так и на представителях незрелорождающихся животных (кошки, крысы) (Григорьян. и др. 2003).