Вопрос 32 Репликация. Принципы репликации днк. Стадии репликации. Инициация. Белки и ферменты, принимающие участие в формировании репликативной вилки.

Репликация ДНК – процесс образования идентичных копий ДНК,

осуществляемый комплексом ферментов и белков.

Она осуществляется в течение S-фазы клеточного цикла и лежит в основе передачи

наследственных признаков при делении клетки

Общие принципы репликации ДНК:

1. Комплементарность – первичная стр-ра дочерней цепи определяется первичной

стр-рой родительской цепи (Ц=Г, А=Т)

2. Антипараллельность – цепи ДНК лежат друг к другу

противоположными концами;

3. Полуконсервативность – каждая дочерняя двуцепочечная молекула ДНК содержит одну цепь из материнской ДНК и одну новосинтезированную;

4. Прерывистость – одна из цепей ДНК синтезируется непрерывно,

а вторая – в виде набора отдельных коротких фрагментов (фрагментов Оказаки);

5. Униполярность – синтез полинуклеотидных цепей всегда идёт

в направлении 5' → 3';

6. Двунаправленность синтеза от одной специфической точки

начала репликации (сайта инициации);

7. Согласованность репликации и клеточного деления.

Стадии репликации:

• Инициация: формирование репликативной вилки, синтез праймера;

• Элонгация: асимметричный синтез ДНК;

• Терминация: вырезание праймеров и сшивание отдельных фрагментов цепи ДНК.

ИНИЦИАЦИЯ

1. Факторы роста – специфические сигнальные белковые молекулы,

регулирующие инициацию репликации. Факторы роста связываются рецепторами мембран клеток, которые передают сигнал, побуждающий клетку к началу репликации.

2. Формирование репликативной вилки: в определённом сайте (точка начала

репликации или «origin», у бактерий такая точка в кольцевом геноме одна, а у эукариотических хромосом их множество – там много скоплений А-Т) происходит локальная денатурация ДНК, цепи расходятся и образуются две репликативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях.

3. Образование праймера: праймаза комплементарна определённому сайту

одноцепочечной ДНК, синтезирует олигонуклеотид около 60 нуклеотидных остатков; первые 8-10 представлены рибонуклеотидами (праймер), остальные – дезоксирибонуклеотидами.

Белки и ферменты, принимающие участие в формировании репликативной вилки:

1. ДНК-топоизомераза I разрывает фосфоэфирную связь в одной из цепей двойной

спирали и ковалентно присоединяется к 5'-концу в точке разрыва – она снимает суперспирализацию.

После формирования репликативной вилки фермент ликвидирует разрыв

в цепи и отделяется от ДНК.

2. ДНК-хеликаза осуществляет разрыв водородных связей в двухцепочечной

молекуле ДНК, использует энергию АТФ.

3. SSB-белки, которые стабилизируют разделенные одноцепочечные фрагменты,

не закрывая азотистые основания (для их считывания), поддерживают в раскрученном состоянии для предотвращения комплиментарного скручивания

4. Праймаза (ДНК-полимераза α) синтезирует затравку в виде праймера –

небольшого фрагмента РНК, необходимого для работы ДНК-полимеразы на стадии элонгации (появляются свободные 3`ОН-группы для присоединения дезоксирибонуклеотидов).

Каждая из четырёх субъединиц фермента выполняет определённую функцию:

"узнавание" сайта репликации, синтез праймера (8-10 рибонуклеотидов),

синтез фрагмента цепи ДНК.

Вопрос 33 Элонгация и терминация репликации. Ферменты. Асимметричный синтез днк. Фрагменты Оказаки. Роль днк-лигазы в формировании непрерывной и отстающей цепи.

Элонгация и терминация осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами.

• Матрица – цепи ДНК.

• Субстраты и источники энергии для синтеза – нуклеотидтрифосфаты: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, для активации которых необходим Mg²⁺

• Синтез цепей ДНК происходит в направлении 5'→3' растущей цепи.

• Продукт – дочерние цепи ДНК.

ЭЛОНГАЦИЯ (синтез)

В синтезе эукариотических ДНК принимают участие 5 ДНК-полимераз (α,β,γ,δ,ε)

• ДНК-полимеразы α, β, δ, ε участвуют в синтезе ДНК в ядре клеток.

• ДНК-полимераза γ участвует в репликации митохондриальной ДНК.

ДНК-полимераза α инициирует репликацию (синтез праймера) – на этапе инициации

1. ДНК-полимераза δ последовательно наращивает цепь, присоединяя

соответствующие дезоксинуклеотиды (перемещается вдоль открытой нити ДНК, присоединяя вновь прибывшие нуклеотиды к свободному 3`ОН-концу новой нити ДНК, комплементарной матричной цепи);

Включение дезоксирибонуклеозидмонофосфатов сопровождается гидролизом

макроэрг.связей соответствующих нуклеозидтрифосфатов и отщеплением пирофосфата. Эта энергия используется на образование 3’-5’-фосфодиэфирной связи между последним нуклеотидом растущей цепи и присоединяемым

Матричная цепь считывается в направлении 3’→5’, а дочерняя синтезируется в

направлении 5’→ 3’ (антипараллельность)

2. Асимметричный синтез днк в направлении 5’→ 3’

В каждой репликативной вилке идёт одновременно синтез двух новых (дочерних)

цепей. Ферментативный комплекс ДНК-полимераз функционирует так, что одна из цепей растет с опережением относительно другой.

• Лидирующая цепь - образуется в виде непрерывного длинного фрагмента, т.к её

направление синтеза цепи ДНК совпадает с направлением движ-я репликативной вилки.

• Запаздывающая цепь – образуется в виде серии коротких фрагментов – «

фрагменты Оказаки». На ней синтез идёт в направлении 5'→3', но против движения репликативной вилки (ведется ДНК-полимеразой ε)

ТЕРМИНАЦИЯ – происходит при встрече 2х репликативных вилок

1. ДНК-полимераза β удаляет праймеры, постепенно

2. Застраивание брешей, образовавшихся после вырезания праймеров

дезоксирибонуклеотидами: на лидирующей цепи 1 праймер – присоединяет к ОН-гр на 3’-конце нуклеотиды в кол-ве, равному, вырезанному праймеру, на отстающей – праймер на каждом фрагменте Оказаки (фермент ДНК-полимераза β);

3. Сшивание фрагментов ДНК (фермент ДНК-лигаза).

Фермент ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между

3'-ОН-группой дезоксирибозы одного фрагмента цепи ДНК и 5'-фосфатом следующего фрагмента. Реакция протекает с затратой энергии АТФ. Таким образом, из множества фрагментов Оказаки образуется непрерывная цепь ДНК.

Метилирование ДНК происходит после завершения репликации. Метилируются

нуклеотиды в определенных последовательностях (например аденин всегда метилируется в последовательностях -GATC-). Метилирование не нарушает комплементарности цепей.

Наличие метильных групп в ДНК необходимо для формирования стр-ры хромосом,

а также для регуляции транскрипции генов. В течение некот. времени метилирование по Аденину происходит только в матричной цепи, это различие используется ферментами репарации для исправления ошибок в синтезированной цепи.

Вопрос 34 Повреждения и репарация днк. Виды повреждений. Способы репарации. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни.

Репарация – процесс, позволяющий живым организмам восстанавливать

повреждения, возникающие в ДНК.

Репарационные механизмы основаны на том, что ДНК – двухцепочечная

молекула, т. е. в клетке есть 2 копии генетической информации.

• Если нуклеотидная последовательность одной из двух цепей оказывается

повреждённой (изменённой), информацию можно восстановить, так как вторая (комплементарная) цепь сохранена.

• Если происходят повреждения, затрагивающие обе цепи ДНК,

то репарация не происходит.

Повреждения ДНК и их причины:

• Ионизирующая радиация;

• УФ-излучение;

• Активные формы кислорода;

• Химические агенты;

• Спонтанные изменения.

Этапы репарации:

1. Выявление нарушения комплементарности цепей ДНК;

2. Устранение некомплементарного нуклеотида или только основания;

3. Восстановление целостности цепи по принципу комплементарности.

Виды репарации:

• Прямая – обеспечивает прямое восстановление исходной структуры ДНК или удаление повреждения.

Например: удаление пиримидиновых димеров под действием фотолиазы.

• Эксцизионная – происходит в несколько этапов сопровождается вырезанием большого фрагмента цепи ДНК.

Например: удаление продуктов реакций дезаминирования.

Виды повреждений:

1. Спонтанные – без участия каких-либо повреждающих факторов.

1.1 Ошибки репликации: происходят ошибки спаривания, и тогда вместо пары

нуклеотидов A–T, G–С в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотиды. ДНК-полимеразы δ, ε способны после присоединения очередного нуклеотида в растущую цепь ДНК делать шаг назад и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной цепи ДНК.

Пока основания нуклеотидных остатков в дочерней цепи неметилированы,

ферменты должны успеть выявить ошибку репликации и устранить её.

1 Этап: распознавание и удаление некомплементарного нуклеотида.

Происходит при участии специальных белков mut S, mut L, mut H.

• Mut S находит неправильную пару и связывается с этим фрагментом.

• Mut Н присоединяется к метилированному (по аденину) участку -GATC-,

расположенному вблизи некомплементарной пары.

• Связующим между mut S и mut Н служит белок mut L, его присоединение завершает образование активного фермента.

Формирование комплекса mut S, mut L, mut H на участке, содержащем ошибку,

способствует проявлению у белка mut Н эндонуклеазной активности. Ферментативный комплекс гидролизует фосфоэфирную связь в неметилированной цепи

2 Этап: к свободным концам цепи присоединяется экзонуклеаза

Отщепляя по одному нуклеотиду в направлении от 3'- к 5'- концу дочерней цепи, она устраняет участок, содержащий некомплементарную пару.

3 Этап: брешь застраивает днк-полимераза β

4 этап: соединение основного и вновь синтезированного участков цепи

катализирует фермент ДНК-лигаза. Для успешного функционирования экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы необходимо участие в репарации хеликазы и SSB-белков.

1.2 Депуринизация: потеря пуриновых остатков вследствие разрыва N-

гликозидной связи между пурином и дезоксирибозой. Образуется участок, лишённый азотистых оснований, названный АП-сайтом (апуриновый сайт). Этот тип повреждений устраняет фермент ДНК-инсертаза, который присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности.

1.3 Дезаминирование: реакции дезаминирования цитозина и превращение его в

урацил, аденина в гипоксантин, гуанина в ксантин. Все продукты дезаминирования легко распознаются ферментами репарации

1 этап: ДНК-N-гликозилаза гидролизует связи между аномальным основанием и

дезоксирибозой, в результате образуется АП-сайт

2 этап: АП-сайт распознаёт фермент АП-эндонуклеаза

3 этап: как только в цепи ДНК возникает разрыв, АП-экзонуклеаза отщепляет от

цепи дезоксирибозу, лишённую основания

4 этап: в цепи ДНК появляется брешь размером в один нуклеотид и

ДНК-полимераза β к 3'-концу разорванной цепи присоединяет нуклеотид по принципу комплементарности

5 этап: ДНК–лигаза соединяет два свободных конца

2. Индуцируемые повреждения – в результате воздействия разнообразных мутагенных факторов как радиационной, так и химической природы.

2.1 Образование димеров пиримидиновых оснований: под действием УФО

двойная связь между С₅ и С₆ атомами углерода в составе пиримидиновых оснований (тимине и цитозине) может разрываться. Атомы углерода остаются связанными одной связью. Расстояние между параллельными плоскостями оснований полинуклеотидной цепи, в которых произошёл разрыв – формируется циклобутановое кольцо.

Удаление пиримидиновых димеров происходит под действием фотолиазы.

Фермент расщепляет вновь образовавшиеся связи между соседними пиримидиновыми основаниями и восстанавливает нативную структуру.

2.2 Повреждения оснований ДНК химическими мутагенами: алкилированию,

окислению, восстановлению или связыванию основания с формамидными группировками.

1 этап: ДНК-N-гликозилаза присоединяется к повреждённому основанию.

Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между изменённым основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП-сайта в цепи ДНК

2 этап: репарация АП-сайта может происходить или только при участии

ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности, или при участии всего комплекса ферментов, участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы, АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и ДНК-лигазы.

Дефекты репарационных систем и наследственные болезни:

• Пигментная ксеродерма: нарушение репарации УФ-повреждений (снижена

активность ферментов, ответственных за удаление неправильных оснований, «застройку» бреши). Дефект репарационной системы проявляется в сверхчувствительности к УФ-свету, что приводит к появлению красных пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи.

• Трихотиодистрофия: повышенная фоточувствительность ДНК, вызванная

снижением активности фермента, участвующего в удалении димеров тимина. Симптомы заболевания: ломкость волос вследствие нехватки серы в белках волос и их луковиц; часто умственная и физическая отсталость; аномалии кожи и зубов.

• Синдром Блума (глубокие поражения капилляров лица) – мутация ДНК-лигазы

Вопрос 35 Транскрипция. Характеристика компонентов системы синтеза рнк. Структура днк-зависимой рнк-полимеразы: роль субъединиц (2ββ′). Инициация процесса. Элонгация, терминация транскрипции.

Транскрипция – первая стадия реализации генетической информации в клетке.

Это синтез всех видов РНК на основе матрицы ДНК

Транскрипция у эукариот происходит в ядре.

Принципы транскрипции:

• Комплементарность – РНК-полимераза синтезирует кмоплементарную реплику с

транскрибируемого участка ДНК (G ≡ C, A=U и Т=А).

• Беззатравочность – транскрипция начинается с НТФ и не требует

затравочных олигонуклеотидов

• Синтез цепи РНК идёт от 5'- к З'-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда

антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте.

• Ассиметричность – транскрибируется лишь одна из цепей ДНК (матричная цепь)

(Вторая, комплементарная ей цепь – кодирующая)

Рибонуклеозидтрифосфаты (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ) – субстраты и источники

энергии, необходимые для протекания полимеразной реакции, образования 3',5'-фосфодиэфирной связи между рибонуклеозидмонофосфатами.

Промоторы – определённые последовательности (сайты) ДНК, с которых

начинается синтез молекул РНК.

Терминаторы – терминирующие участки, в которых завершается синтез РНК.

Транскриптон – участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации,

представляет собой единицу транскрипции. В каждом транскриптоне присутствует неинформативная зона, которая содержит специфические последовательности нуклеотидов, с которыми взаимодействуют регуляторные транскрипционные факторы.

Транскрипционые факторы – белки, взаимодействующие с регуляторными

сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции.

Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах

• У эукариот составляет в среднем 1:9

• У прокариотов 9:1

Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга

нетранскрибируемыми участками ДНК. Разделение ДНК на множество транскриптонов позволяет осуществлять с разной активностью транскрипцию разных генов.

Биосинтез РНК осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами.

• РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК;

• РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК;

• РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК.

РНК-полимеразы – олигомерные ферменты, состоящие из 5 субъединиц– 2 α,β,β',σ.

Это holo-фермент (полный фермент). Без -фактора (2 α, β, β') – core-фермент.

• Стадии узнавания и связывания, а также инициации осуществляются holo-ферментом.

• Элонгация и терминация осуществляются core-ферментом.

Роль субъединиц: две α-субъединицы – каркас РНК-полимеразы, к ним крепятся

остальные субъединицы; β' -субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминок-т. В β-субъединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой – за элонгацию.

Субъединица σ «сигма» выполняет регуляторную функцию, это один из факторов

инициации транскрипции. РНК-полимеразы I, II, III, узнающие разные промоторы, содержат разные по строению субъединицы σ.

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ

1. Активация промотора происходит с помощью большого белка – ТАТА-фактора,

взаимодействующего со специфической последовательностью нуклеотидов, входящего в состав промотора – ТАТА-бокс

2. Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с

РНК-полимеразой. Факторы инициации вызывают изменение конформации

РНК-полимеразы и обеспечивают раскручивание примерно одного витка спирали ДНК, т.е. образуется транскрипционная вилка, в которой матрица доступна для инициации синтеза цепи РНК.