Материал: 32-37

3. После того как синтезирован олигонуклеотид из 8-10 нуклеотидных остатков,

σ-субъединица отделяется от РНК-полимеразы, а вместо неё к молекуле фермента присоединяются несколько факторов элонгации.

1 – присоединение ТАТА-фактора к промотору.

2 – образование транскрипционной вилки;

3 – элонгация; 4 – терминация

ЭЛОНГАЦИЯ

Факторы элонгации повышают активность РНК-полимеразы и облегчают

расхождение цепей ДНК. Синтез молекулы РНК идёт от 5'- к З'-концу комплементарно матричной цепи ДНК. На стадии элонгации, в области транскрипционной вилки, одновременно разделены примерно 18 нуклеотидных пар ДНК.

Растущий конец цепи РНК образует временную гибридную спираль, около 12 пар

нуклеотидных остатков, с матричной цепью ДНК. По мере продвижения РНК-полимеразы по матрице в направлении от 3'- к 5'-концу впереди неё происходит расхождение, а позади – восстановление двойной спирали ДНК.

ТЕРМИНАЦИЯ

Раскручивание двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его

доступным для фактора терминации. Завершается синтез РНК в строго определенных участках матрицы – терминаторах (сайты терминации).

Фактор терминации облегчает отделение первичного транскрипта (пре-мРНК),

комплементарного матрице, и РНК-полимеразы от матрицы. РНК-полимераза может вступить в следующий цикл транскрипции после присоединения субъединицы σ.

У бактерий существует 2 механизма терминации транскрипции:

1. ρ-зависимый механизм, при котором ρ-белок дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и мРНК, высвобождая молекулу РНК.

2. ρ-независимый, при котором транскрипция останавливается, когда только что синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов (....УУУУ), что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.

Вопрос 36 Первичный транскрипт и его процессинг. Рибозимы как пример каталитической активности нуклеиновых кислот. Биороль.

Первичные транскрипты мРНК подвергаются ряду ковалентных модификаций до

их использования в качестве матрицы в синтезе белка.

1. Модификация 5'-конца: модификации пре-мРНК начинаются на стадии

элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных

остатков, происходит кэпирование его 5'-конца.

Осуществляет кэпирование гуанилилтрансфераза, кот. гидролизует

макроэргическую связь в молекуле ГТФ и присоединяет нуклеотиддифосфатный остаток 5'- фосфатной группой к 5'-концу синтезированного фрагмента РНК с образованием

5',5'- фосфодиэфирной связи.

Последующее метилирование остатка гуанина в составе ГТФ с образованием

N7-метилгуанозина завершает формирование кэпа.

Значение: модифицированный 5'-конец обеспечивает инициацию трансляции

(рибосома для синтеза белка распознает только кэпированный конец), защищает от действия 5'-экзонуклеаз в цитоплазме, стимулирует сплайсинг (удаление интронов)

2. Модификация 3'-конца: 3'-конец большинства транскриптов, синтезированных

РНК-полимеразой II, также подвергается модификации, при которой специальным ферментом полиА-полимеразой формируется полиА-последовательность (полиА-«хвост»), состоящая из 100-200 остатков адениловой кислоты.

• Сигналом к началу полиаденилирования является последовательность

-AAUAAA- на растущей цепи РНК.

• Фермент полиА-полимераза, явл. экзонуклеазой,, разрывает 3'-фосфоэфирную связь после появления в цепи РНК специфической последовательности -AAUAAA

• К 3'-концу в точке разрыва полиА-полимераза наращивает полиА-«хвост».

• Наличие полиА-последовательности на 3'-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет её гидролиз в цитоплазме.

• Первичный транскрипт – строго комплементарная матрице нуклеиновая кислота

(пре-мРНК), содержащая экзоны и интроны.

• Интроны – некодирующие последовательности нуклеотидов, присутствующие в ДНК, но не входящие в состав зрелой мРНК.

• Экзоны – кодирующие последовательности, присутствующие в мРНК.

Сплайсинг – вырезание интронов из первичного транскрипта и сшивание концов

экзонов друг с другом. В результате сплайсинга, происходящего в ядре, из первичных транскриптов мРНК образуются молекулы «зрелой» мРНК, поступающие далее в цитоплазму к рибосомам для синтеза белка.

Процесс «вырезания» интронов протекает при участии малых ядерных

рибонуклеопротеинов (мяРНП), в состав кот. входит малая ядерная РНК (мяРНК), нуклеотидная цепь которой связана с белковым остовом, состоящим из нескольких протомеров.

На первой стадии процесса мяРНП связываются со специфическими

последовательностями первичного транскрипта (сайты сплайсинга), далее к ним присоединяются другие мяРНП.

Сплайсосома – десятки белков и 6 мяРНК, обеспечивающих сплайсинг

Она катализирует реакцию расщепления 3',5'-фосфодиэфирной связи на границе

экзона с интроном. Последовательность интрона удаляется, а два экзона соединяются.

Образование 3',5'-фосфодиэфирной связи между двумя экзонами катализируют мяРНК, входящие в структуру сплайсосомы.

Рибозимы – это каталитически активные молекулы РНК.

У прокариотов рибозимы осуществляют самосплайсинг, в процессе которого

интроны, расположенные между экзонами первичных транскриптов РНК «выщепляют сами себя» из молекулы РНК и сшивают кодирующие последовательности, образуя зрелую мРНК. Отличительной особенностью таких каталитически активных интронов считают высокую специфичность в отношении фосфодиэфирных связей определенных участков на РНК.

В клетках эукариот сплайсинг незрелых молекул мРНК осуществляет сплайсосома

с входящими в состав мяРНК.

В медицине рибозимы используют для расщепления специфических мРНК-

мишеней, что приводит к нарушению биосинтеза соответствующего белка.

Вопрос 37 Регуляция транскрипции у прокариот. Теория оперона, регуляция по типу индукции и репрессии (примеры).

Теория оперона (Жакоба и Моно): оперон – структурная единица генома

прокариот, представляющая собой комплекс генов белков, функции которых в метаболических процессах тесно связаны.

Включает:

1. Структурные гены;

2. Промотор – участок ДНК, распознаваемый РНК-полимеразой;

3. Оператор – участок ДНК, к которому присоединяется регуляторный белок.

Ген-регулятор отвечает за синтез регуляторного белка, не входит в состав оперона.

Структурные гены оперона экспрессируются согласованно, либо все они

транскрибируются – оперон активен и синтезируется полицистронная мРНК, служащая матрицей для синтеза всех белков этого оперона, либо ни один из генов

не прочитывается – оперон неактивен.

Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-

репрессора на операторе. Белок-репрессор синтезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к операторному участку.

Структурно участки промотора и оператора частично перекрываются, поэтому

присоединение белка-репрессора к оператору создаёт стерическое препятствие для присоединения РНК-полимеразы.

Пример индукции синтеза белков: Lac-оперон (лактозный оперон) Е. coli, -

оперон, в котором закодированы белки, участвующие в усвоении лактозы.

Клетки Е. coli обычно растут на среде, используя в качестве источника углерода

глюкозу. Если в среде культивирования глюкозу заменить на лактозу, то через нескольких минут клетки адаптируются к изменившимся условиям и начинают продуцировать 3 белка, обеспечивающих утилизацию лактозы. Один из этих белков – фермент β-галактозидаза, катализирующий гидролиз лактозы до глюкозы и галактозы.

Так, в отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором, что

препятствует связыванию РНК-полимеразы с промотором, и транскрипция структурных генов оперона не идёт. Если в среде появляется индуктор (лактоза), то он присоединяется к белку-репрессору, изменяет его конформацию и снижает сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены.

Пример репрессии синтеза белков: триптофановый и гистидиновый опероны

Снижение конц. фермента в бактер. клетке путём репрессии синтеза ферментов.

Клетки Е. coli растут на среде, содержащей в качестве источника азота соль

аммония, и им необходимо синтезировать все ферменты, необходимые для синтеза 20 АК.

Если добавить в среду одну из аминокислот, например, триптофан или гистидин, то

клетка перестанет вырабатывать ферменты, необходимые для синтеза этих аминокислот из аммиака и источника углерода (репрессия конечным продуктом).

При отсутствии в среде Гис или Три регуляторный белок-репрессор не имеет

сродства к оператору и происходит синтез ферментов для построения АК.

Когда в среду добавляют Гис, (корепрессор), он присоединяется к белку-

репрессору. В результате конформационных изменений в молекуле репрессора комплекс белка-репрессора и корепрессора (Гис) приобретает сродство к оператору, присоединяется к нему, и транскрипция оперона прекращается.