Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Воронежский государственный лесотехнический университет
им. Г.Ф. Морозова»
БИОТЕХНОЛОГИЯ.
РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВНИЙ СЕЯНЦЕВ ЛЕСНЫХ ПИТОМНИКОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
методические указания к практическим занятиям
для студентов по направлению подготовки 35.04.09 Ландшафтная архитектура
ВОРОНЕЖ 2018
1
УДК 630*
Биотехнология. Ранняя диагностика заболеваний сеянцев лесных питомников с помощью методов молекулярно-генетического анализа [Электронный ресурс]: методические к практическим занятиям для студентов по направлению подготовки 35.04.09 Ландшафтная / В. А. Сиволапов, Н. А. Карпеченко, В. Н. Вепринцев, И. Ю. Карпеченко, А. И. Сиволапов; М-во науки высшего образования РФ, ФГБОУ ВО «ВГЛТУ». – Воронеж, 2018. – 24 с.
Печатается по решению учебно-методического совета ФГБОУ ВПО «ВГЛТУ».
Методические указания предлагаются для обучения и подготовки магистров по предмету «Биотехнология», специалистам генетических лабораторий по молекулярно-генетическому анализу.
Методические указания могут быть использованы при обучении слушателей по соответствующим программам дополнительного профессионального образования.
Рецензент:
канд. биол. наук, зав лабораторией лесной биотехнологии ВНИИЛГИСбиотех О.С. Машкина
Ответственный за выпуск канд. с.-х. наук проф, А. И. Сиволапов
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Список основных терминов………………………………………………… 4
Введение…………………………………………………………………….. 5
1.Общая часть………………………………………………………….. 6
2.Методика видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных питомников с помощью молекулярно-генетических методов анализа………………………………………………………………………. 8
2.1 Сбор образцов с лесных питомников для ДНК-анализа ..................... 8
2.2Протокол выделения ДНК……………………………………………… 8
2.3Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК …………... 9
2.4Протокол постановки ПЦР…………………………………………….. 10
2.5 Протокол постановки электрофореза в агарозном геле……………… 11
2.6Протокол выделения и очистки ампликона из агарозного геля (на примере наборов Eurugen Cleanup Mini).………………………………….. 11
2.7Протокол постановки секвенирующей ПЦР………………………….. 12
2.8Протокол очистки проб набором BigDye® XTerminator Purification Kit…………………………………………………………………………….. 12
2.9Протокол определения структуры ДНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 310………………………………………………. 13
2.10Протокол анализа результатов секвенирования……………………. 15
3. Описание некоторых заболеваний сеянцев лесных питомников, выявленных с помощью методов молекулярно-генетического анализа, и
методы борьбы с ними……………………………………………………… 16
Библиографический список………………………………………………… 20 Приложение 1. Список оборудования для видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных питомников с помощью молекулярногенетических методов анализа……………………………………………... 22 Приложение 2. Список химических реактивов и пластиковой посуды на различных этапах работ для видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных питомников с помощью молекулярно-генетических методов анализа…………………………………………………………….. 23
3
СПИСОК ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ
Биотехнология – наука о методах и технологиях производства продуктов с использованием биологических объектов.
Генотип – совокупность генов организма.
Генная инженерия – совокупность методов молекулярной генетики,
направленных на получение рекомбинантных нуклеиновых кислот,
осуществление манипуляций с генами.
Денатурация биополимеров – изменение структуры молекулы, вызывающее потерю её естественных свойств.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) – биологический полимер, носитель наследственной информации всех живых организмов. В ядре клетки она представлена в виде хромосом.
Лиофилизат – продукт лиофилизации (способ мягкой сушки вещества)
Митотип – генотип по митохондриальной ДНК.
Отжиг праймера – присоединение праймера к ДНК-матрице.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод амплификации (многократного копирования) небольших количеств фрагментов ДНК.
Праймер – последовательность из нескольких десятков нуклеотидов,
используемая для ПЦР.
Секвенирование – определение нуклеотидной последовательности.
Фитопатогены – инфекционные болезни растений.
Хладагент – вещество, используемое для охлаждения при термостатировании.
Электрофорез – метод разделения белков и нуклеиновых кислот под действием электрического поля.
Элонгация – процесс удлинения нуклеотидной последовательности.
BLAST – Интернет ресурс, применяемый для сравнения нуклеиновых последовательностей.
4
ВВЕДЕНИЕ
Внастоящее время быстро развиваются и внедряются в лесохозяйственную деятельность России различные методы биотехнологии и генной инженерии.
Решение ряда важнейших проблем в области лесной генетики не было возможно ввиду отсутствия соответствующего оборудования и апробированных методик работ.
Инновационные технологии, внедрённые в современное лесное хозяйство, при их рациональном использовании, способны дать положительный эффект в развитии отрасли и вывести её на качественно новый уровень. Исключением не является и анализ ДНК как растений, так и их патогенов.
Вданной работе большое внимание было сконцентрировано на модернизации и апробации общепринятых методик и протоколов выделения, идентификации заболеваний инфекционного происхождения древесных растений. Исследования проведены в ходе плановых работ отдела лесной генетики филиала ФБУ «Рослесозащита»-«ЦЗЛ Воронежской области».
Приведённые ниже протоколы могут быть использованы при подготовке специалистов высших учебных заведений в области молекулярной генетики и прочих специалистов производств лесного хозяйства.
5