2.5. Протокол постановки электрофореза в агарозном геле
Приготовить агарозный гель (сварить) необходимого состава и объёма.
Состав 2 % агарозного геля: агароза 2 %,трис-ацетатный буфер 2 % (pH 8,5, 2 М
трис, 0,5 М ЭДТА, уксусная кислота, дистиллированная вода), вода до конечного объема. Необходимый объём геля выбирается, исходя из вместимости заливочного столика электрофоретической камеры. Собрать заливочный столик. После охлаждения геля до температуры 55 °С добавить бромистый этидий (0,01 % от объёма геля), хорошо перемешать и залить в заливочный столик. Вставить гребёнку. Застывший гель переместить в электрофоретическую камеру. Смешать краситель с пробами (их соотношение зависит от кратности красителя, указанной на упаковке). Закрыть камеру и включить источник питания. После окончания электрофореза поместить гель в систему гель-документации для анализа результата.
2.6. Протокол выделения и очистки ампликона из агарозного геля
(на примере наборов Eurugen Cleanup Mini)
Вырезать фрагменты проб из агарозного геля. Поместить вырезанные фрагменты геля в микроцентрифужные пробирки. Взвесить фрагменты геля.
К каждой пробе добавить три объёма (в данном случае объём приравнивается к массе фрагмента геля) «Связывающего раствора».
Инкубировать пробы при 53 °С до полного растворения геля, перемешивая.
Весь объём пробы перенести в собранные колонки. Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Слить жидкость из собирательной пробирки и добавить в каждую пробу по 700 мкл «Промывочного раствора».
Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд. Удалить жидкость из собирательной части колонки. Центрифугировать колонки при
13 000 g 60 секунд. Колонки переместить в чистые микроцентрифужные
11
пробирки. Нанести дозатором на мембрану колонки 12 мкл «Элюирующего раствора». Центрифугировать колонки с пробами при 13 000 g 30 секунд.
2.7. Протокол постановки секвенирующей ПЦР
Концентрация ДНК-матрицы для расчета количества, используемого на секвенирующую реакцию, определяется спектрофотометрически (см. п. 2.3).
В микроцентрифужную пробирку внести 10 мкл реакционной смеси
(Terminator Ready Reaction Mix, праймер (3 мкМ р-р), ДНК-матрица,
деионизованная вода). Соотношение компонентов подбирается эмпирически.
Программа амплификации:
1. Первичная денатурация 95 °С - 1 мин.
Затем 25 - 30 циклов:
1.Денатурация 95 °С - 10 сек.
2.Отжиг 50 °С - 10 сек.
3.Элонгация 60 °С - 4 мин.
Охлаждение реакционной смеси до 4 °С 5 мин.
Хранение 4 °С - ∞
После секвенирующей ПЦР необходимо провести очистку продукта от непрореагировавших компонентов.
2.8. Протокол очистки продуктов секвенирующей ПЦР набором
BigDye® XTerminator Purification Kit
Добавить к пробам по 45 мкл буфера «SAMSolution». Тщательно промешать на вортексе «XTerminatorSolution» и быстро добавить к пробам по
10 мкл. Перемешивать в течение 30 минут. Центрифугировать пробы на 1 000 g
2 минуты. Отобрать не менее 10 мкл супернатанта в пробирки для последующего определения нуклеотидной последовательности.
12
2.9. Протокол определения структуры ДНК на генетическом анализаторе ABI PRISM 310
Электрофоретический анализ и детекцию провести на секвенаторе ABI
PRISM 310 в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией.
1. Подготовка прибора к работе
Установка ячейки. Открыть двери прибора. В промытую1 dH20 и
высушенную ячейку вкрутить три чистые ферулы (верхняя, нижняя,
капиллярная). Вставить ячейку в прибор по направляющим металлическим штырям.
Установка шприца. В чистый сухой шприц2 медленно набрать полимер
(max 0,8 мл). Протереть шприц. Отвернуть лапку привода шприца на приборе
влево. Вкрутить шприц в ячейку (правая верхняя).
Установка капилляра3. Открыть дверцу печки. Поместить конец капилляра в перекрестье каналов ячейки и закрепить боковой ферулой. Второй конец капилляра пропустить в отверстие шайбы крепления электрода и закрепить так, чтобы конец капилляра выступал на полмиллиметра.
Расположить просвет капилляра напротив окна детектора, совместив метки, и
закрыть крышку. Окончательно закрепить капилляр термо-скотчем и закрыть
дверцу печки. Поместить свободный конец капилляра в буфер.
2. Запуск прибора
Включение прибора и заполнение ячейки. Включить прибор. Включить
ПК. Запустить ПО – Data collection. Закрыть клапан буферной ячейки: Window>>Manual control>>Function>>Buffer valve close >>Execute. Закрутить верхнюю ферулу и открутить нижнюю. Продавить полимер до выхода из
отверстия нижней ферулы: Data collection>>Window>>Manual
control>>Function>>Syringe down>>указать Value (для более короткого шага использовать shift down)>>Execute. Закрутить нижнюю и открутить верхнюю ферулу. Продавить полимер до выхода из отверстия верхней ферулы. Закрутить
верхнюю |
ферулу |
и |
открыть |
клапан: |
Window>>Manual |
|
|
|
13 |
|
|
control>>Function>>Buffer valve open>>Execute. Продавить полимер до выхода из отверстия клапана. Закрыть клапан.
Калибровка и диагностика
Калибровка автосемплера: Data collection>>Window>>Manual control>>Autosample colabration>>Tray>>Снимаем адаптер>>Фиксируем капилляр на точке в соответствии с изображением на экране>>Start>>Page up
поднимаем автосемплер вверх (shift up – более мелкие шаги), когда закончилось позиционирование, нажать set (нужно обращать внимание, какой текст отображается в диалоговом окне)>>Resume.
Диагностика детектора: Date collection>>File>>New Injection list>>SeQuensingtestsens, sss>>Modute>>Test CCD 4-colour>>Run.
Установка проб. Закрепить пробы на мягких септах. Нажать Tray.
Собрать сендвидж и установить его в автосемплер. Нажать Tray. Закрыть дверцы прибора.
Включение печки: Data collection>>Window>>Manual control>>Temperature set>>Value 50>>Execute>>Window>>Status.
Запуск секвенирования: Data collection>>File>>New>>Sequence sample sheet на 96 образцов>>Sample name (назвать образцы, согласно занимаемому месту в штативе)>>Save as>>Закрыть все диалоговые окна для обновления полученной информации>>File>>New>>Injection list>>Выбирать созданный sample sheet (в дальнейшем будет пониматься, как матрикс)>>Выбрать module>>Задать условия электрофореза>>Run.
3. Завершение работы.
Открыть дверцы прибора. Изъять образцы: Tray>>Разобрать и промыть сендвидж>>Tray. Закрыть и выключить прибор.
Примечание:
1 Промывание ячейки. Отсоединить чашку с буфером и капилляр от ячейки, вынуть её из прибора. Последовательно промыть каналы ячейки dH20
через все ферулы пластиковым шприцем. Продуть каналы ячейки воздухом из шприца и дать высохнуть при комнатной температуре.
14
2Промывание шприца. Отвернуть лапку привода шприца на приборе влево. Data collection>>Window>>Manual control>>Function>>Syring home>>Execute. Открутить шприц, избавить от остатка полимера и десять раз промыть dH20. При необходимости перед промывкой можно разобрать шприц.
Дать высохнуть при комнатной температуре.
3Капилляр вне упаковки и прибора хранить погруженным концами в деионизованную воду.
2.10. Протокол анализа результатов секвенирования
Использование программного обеспечения SeqA6. Запустить SeqA6.
Загрузить данные: File>>AddSample(s)…>> в диалоговом окне выделить файлы сырых данных секвенирования с именами образцов, лежащих в папке с именем-
датой в директории «Runs»1 >>нажать кнопку «Add Selected Samples»>>Ok. В
открывшемся окне выбрать содержимое ячейки «DeySet/Primer» – подходящий набор химии и капилляр. Установить галочку в ячейке «Show». Нажать кнопку
> (play). Во вкладке «Sequenсe» появится нуклеотидная последовательность образца. После анализа (см. инструкцию к ПО) сохранить последовательности образцов.
Использование BLAST. Открыть в браузере страницу http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Выбрать он-лайн приложение BLAST или перейти по ссылке > http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSear ch&LINK_LOC=blasthome. Скопировать последовательность образца из SeqA6
в соответствующее окно ресурса. Запустить анализ>>нажать <BLAST>.
Примечание:
1 Директория «Runs» обычно расположена по пути: <Корневой каталог>:\AppliedBio\310\Runs.
15