Материал: 4037

1. ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Одним из действенных способов недопущения роста численности вредных организмов, приносящих существенный ущерб от потери качества и количества как репродуктивного материала лесных питомников, так и древостоев, является их ранняя диагностика и профилактика с применением современных способов защиты и воспроизводства леса. В связи с этим возникает необходимость введения в практику современного лесного хозяйства фитосанитарных обследований состояния лесных питомников на основе методов молекулярно-генетического анализа. Они позволят поставить точный диагноз и узнать происхождение репродуктивного материала при наличии региональной базы данных митотипов основных лесообразующих пород. Во многом состояние и продуктивность создаваемых лесных культур зависит не только от факторов внешней среды, но и от качества и происхождения посадочного материала. На сегодняшний день оборудование и реактивы для ДНК-анализа являются весьма дорогостоящими, однако их стоимость оправдана экономической и экологической целесообразностью, заключающейся в предупреждении увеличения площади и степени поражения патогенами, по сравнению с проведением лесозащитных мероприятий и последующих лесовосстановительных работ.

Причиной повреждения и усыхания лесных растений служит воздействие ряда факторов абиотической и биотической природы, а также антропогенной – нарушение агротехники выращивания посадочного материала, несоблюдение условий хранения, технологии предпосевной обработки и посева семян. Нередко неблагоприятные погодные условия (аномальные засухи, град и т. д.), повреждения насекомыми приводят к ослаблению биологической устойчивости растения и создают предпосылки для поражения различными болезнями.

Важной особенностью для ведения хозяйства является наличие инкубационного периода инфекционных заболеваний – времени от начала заражения до появления первых признаков. Длительность этого периода зависит от способа заражения и вида возбудителя и может продолжаться от нескольких часов до нескольких лет.

Практическая значимость методов молекулярно-генетического анализа заключается в диагностике заболеваний уже на ранних стадиях, трудно идентифицируемых заболеваний и для уточнения диагноза, поставленного по морфологическим признакам.

6

Диагностика фитопатогенов включает в себя ряд технологических этапов: выделение генетического материала (ДНК) из лесных растений, амплификация маркерных участков фитопатогенов, определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов, анализ и идентификация патогенов в базе данных (рис. 1).

…AGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTG…

Идентификация в базе данных

Расшифровка ДНК фитопатогена (секвенирование)

Рис.1. Схема видовой идентификации фитопатогенов сеянцев лесных питомников с помощью молекулярно-генетических методов

Ранее используемый метод фитопатологического анализа посадочного материала в лесных питомниках основан на обнаружении внешних признаков болезней: изменение цвета ассимиляционного аппарата или отдельных органов растения, наличие поверхностных спороносящих органов грибов и др. Он не позволяет осуществить своевременную профилактику и лечение заболеваний, что приводит к существенному экономическому и экологическому ущербу.

В связи с вышеизложенным, использование ДНК-анализа представляется более целесообразным, так как позволяет обнаружить поражение культур в питомниках на ранних стадиях и предупредить его распространение.

7

2. МЕТОДИКА ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕНОВ СЕЯНЦЕВ ЛЕСНЫХ ПИТОМНИКОВ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА

2.1. Сбор образцов с лесных питомников для ДНК-анализа

Отбор образцов для генетического анализа осуществляют в количестве

20-50 поражённых растений каждой возрастной группы. Отобранные растения высушивают, этикетируют и отсылают в бумажных пакетах в ДНК-

лабораторию для последующего анализа.

В случае отсутствия поражённых растений в питомнике для оценки его фитосанитарного состояния осуществляют отбор растений без внешних признаков заболевания. Сбор проводят по диагонали производственного отделения или в шахматном порядке.

Для молекулярно-генетического анализа могут быть использованы любые части растения: хвоя, листья, стебель, корни. Однако лучше выделять ДНК из поражённого ассимиляционного аппарата.

Помимо растительных тканей возможно выделение ДНК патогенов из почвы, воды и насекомых.

2.2. Протокол выделения ДНК

Небольшой фрагмент ткани поместить в ступку для растирания, добавить

1мл прогретого ЦТАБ-буфера (3 % бромид цетилтриметилламоний (ЦТАБ), 1.4

М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис, вода деионизованная) и максимально гомогенизировать образец.

Переместить гомогенат в заранее прогретые в термостате до 65 °С

центрифужные пробирки типа эппендорф. Инкубировать 5-7 мин. Навести и внести в каждую пробу равный объём смеси хлороформ : изоамиловый спирт

(24:1 соответственно) (работа под вытяжкой). Тщательно перемешать пробы в

течение 1-2 минут. Центрифугировать пробы 2-3 минуты при 13 000 g.

8

Перенести супернатант в микроцентрифужные пробирки типа эппендорф.

Среднюю и нижнюю фазы в дальнейшей работе не используют. Внести в каждую пробу 0,7 объёма охлажденного в морозилке изопропилового спирта

(работа под вытяжкой). Тщательно перемешать пробы в течение 1-2 минут.

Центрифугировать пробы 2-3 минуты на максимальных оборотах. Слить жидкость и оставить пробы обсохнуть на воздухе. Добавить в пробирки с пробами этиловый спирт 96 %. Тщательно перемешать в течение 2-3 минут.

Удалить жидкость из проб. Повторить процедуру промывки этанолом.

Высушить осадок. Добавить в пробы минимально необходимое для растворения осадка количество мQ-воды. Растворить до полного исчезновения осадка. Выделенные ДНК необходимо хранить при –20 °С.

2.3. Спектрофотометрическое измерение концентрации ДНК

Поскольку концентрация и чистота препарата ДНК являются важными факторами, влияющими на ход дальнейшего анализа, необходимо установление значений этих показателей с помощью спектрофотометра. Для определения количества ДНК измеряют поглощение раствора в областях с длинами волн

260 и 280 нм. Измерение при 260 нм позволяет рассчитать концентрацию нуклеиновой кислоты в пробе. Оптическая плотность D = 1 A соответствует приблизительно 50 мкг/мл двухцепочечной ДНК. Соотношение экстинкции

260/280 нм позволяет судить о чистоте нуклеиновой кислоты. Коэффициент отношения волн 260/280 нм для чистых препаратов ДНК должен укладываться в переделы 1,7 – 2,0. Коэффициент отношения волн 230/260 нм должен быть в переделах 0,3 – 0,9. Выход за параметры этих значений будет свидетельствовать о чрезмерном загрязнении образцов примесями (белки,

фенолы, соли и др.). Привести концентрации проб к оптимальному значению путем разбавления водой.

9

2.4. Протокол постановки ПЦР

Подготовить необходимые компоненты ПЦР-смеси. В штатив с хладагентом поместить пробирки, предназначенные для проведения ПЦР.

Рассчитать общее количество компонентов. Навести суммарную смесь в одной пробирке и разнести поровну в остальные. Добавить в каждую пробирку соответствующую ДНК-матрицу и довести водой до конечного объёма.

Состав ПЦР-смеси на 25 мкл: 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера, 2,5 мкл 25 мМ

MgCl2, 1 мкл 10 мМ смесь дНТФ (дезоксинуклеотид трифосфаты), 1 ед. Taq-

ДНК-полимеразы, по 1 мкМ прямого и обратного праймеров, ДНК-матрицы (её объем зависит от концентрации полученной ДНК), деионизованной воды до 25

мкл. Перемешать, поместить в амплификатор, запустить необходимую программу.

Классический вид программы ПЦР для амплификатора (стадии со 2 по 4

повторяются циклически в количестве 25-40):

1.Первичный прогрев 95 °С - 5 мин.

2.Денатурация 90–95 °С - 15 сек. Происходит расщепление двухцепочечной молекулы ДНК.

3.Отжиг 20 сек (температура отжига зависит от длины и нуклеотидного состава праймера и устанавливается оптимизированной для используемых праймеров (40–60 °С)).

4.Элонгация 72 °С - 40 сек

5.Конечная элонгация 72 °С - 5 мин.

6.Хранение 4 °С - ∞

Состав смеси и программа ПЦР могут варьироваться и подбираются экспериментально.

10